利用离子交换法分离草酸青霉发酵液中的三峡肽素

刘 静 罗 卉 薛艳红 刘呈雄 李 奥 林 强 刘士平

(1.三峡大学 生物与制药学院, 湖北 宜昌 443002;2.优联康生物科技有限公司, 湖北 宜昌 443001)

三峡肽素是近年来在草酸青霉的发酵液中发现的一种抗真菌五肽,它可以显著延长柑橘类水果的货架期,是一种潜在的安全有效的天然保鲜剂[1].其结构组成为Amoba-N-Me-L-Thr-D-Thr-N-Me-L-Val-L-Ser,分子式为C23H43N5O10,分子量为549.61[2].在实验室中其分离方式是将发酵液酒精沉淀后,再取上清旋蒸浓缩,然后通过高效液相进行制备[2],但分离收率低[2]、成本很高,不适合大规模工业化生产.

钙盐提取法、溶剂萃取法、膜分离法及离子交换法等是从发酵液中大规模分离提取肽类物质的常用方法[3-4].钙盐提取法的固液分离量大、总收率低、能耗高,且在生产过程中会产生大量的废水、废渣,严重污染环境[4].溶剂萃取法在萃取剂的选择上具有一定的难度,大多萃取剂均有一定的毒性和异味,不能满足食品医药等行业的要求[5-6].在膜分离法中,由于膜孔易堵塞,膜面易发生污染致使膜分离性能降低使用寿命短等,造成其成本过高[7-8].离子交换法是利用离子交换树脂中的可交换基团与溶液中各种离子间的离子交换能力的不同来进行分离的一种方法[9-10],相对而言它收率高、工艺简单、能耗低,且所用树脂无毒、成本低、可反复使用,现被广泛应用于食品、制药、环保等领域[11].

为了找到适合三峡肽素的工业化分离方法,本文分别探索了阴离子型和阳离子型树脂对三峡肽素的分离效率,分析了不同上样p H、洗脱p H、洗脱盐氯化钠浓度等工艺条件对其收率的影响,并对不同离子交换树脂分离后样品的色素及残糖含量进行了解析,明确了离子交换树脂分离三峡肽素的最佳工艺条件.

1 材料与仪器

1.1 仪器与设备

SW-CJ-2FD 型双人实验操作台(苏州净化设备厂);YM30F不锈钢智能型立式电热蒸汽消毒器(上海三申医疗器械有限公司);岛津高效液相色谱仪紫外-可见光检测器(SPD-16)(岛津仪器苏州有限公司),Neptune C18液相柱(250 mm×4.6 mm,5μm);电脑紫外检测仪(上海杰涵实验设备有限公司);恒流泵(保定齐力恒流泵有限公司);层析柱(内径26 mm、长度20 cm,北京金鼎生物科技有限公司);高性能固液分离过滤设备(兴化市三青过滤设备制造有限公司).

1.2 菌株和试剂

草酸青霉SG-4来源于三峡河岸带植物疏花水柏枝(Myricarialaxiflora)的内生真菌(2015 年4 月30日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC M 2015270,湖北,武汉大学).色谱级甲醇(山东德彦化工有限公司)、乙腈(美国天地Tedia,福州奥研实验器材有限责任公司),732 强酸苯乙烯阳离子交换型树脂、D201大孔强碱阴离子交换型树脂(上海南开树脂有限公司).

2 实验内容及方法

2.1 发酵培养与样品制备

菌株的活化及种子液培养按照文献[1-2]介绍的方法进行,将种子液按照10%的接种量置入50 L发酵罐中于22℃进行培养,转速控制在150～200 r/min之间,p H 控制在5.5～6.0之间,培养4 d后获得草酸青霉SG-4发酵液.采用用板框过滤器滤掉菌丝,将滤液的p H 分别调整为3.2、4、5、6、7、8、9、10,然后进行真空抽滤.通过查阅相关文献[2],25℃下1 mol/L的Na Ac-HAc缓冲液的有效缓冲范围在3.2到6之间,故最低将发酵滤液p H 调节到3.2,考虑到碱性过强可能影响三峡肽素的生物活性,故最高将发酵滤液p H 调节到10.

2.2 离子交换法分离三峡肽素

将适量732 强酸苯乙烯阳离子交换型树脂和D201大孔强碱阴离子交换型树脂润湿,然后装入玻璃层析柱(内径=26 mm、长度=20 cm)中,装量约柱子的60%左右.用纯水将树脂冲洗干净后,分别用4%HCl溶液、4%NaOH 溶液和4%HCl溶液进行处理约30 min,再用纯水洗至p H 中性.为了维持缓冲平衡,732型阳离子树脂加入NaAc-HAc缓冲液,D201型阴离子树脂加入适量的Na HCO3-Na OH 缓冲液.柱子预处理完毕后,将收集的发酵滤液通过恒流泵导入层析柱中,然后分别用不同浓度的氯化钠溶液洗脱(洗脱液浓度为0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 mol/L,考虑到1 mol/L 氯化钠洗脱强度过大,可能会把色素洗脱下来,故舍弃此浓度),上样和洗脱速度均为4 BV/h,收集洗脱液进行进一步分析.最后用4%的HCl溶液和去离子水将树脂冲洗至中性,促进树脂的再生.

2.3 三峡肽素的含量分析

为评价不同离子交换树脂对三峡肽素的分离能力,采用高效液相色谱的峰面积来计算发酵液原液、发酵液离子交换流出液、离子交换洗脱液、洗脱浓缩液等样品中三峡肽素的含量[2].检测器:DAD 检测器;色谱柱:Neptune C18液相柱;检测波长:210 nm;进样体积:50μL;流速:1.0 m L/min;流动相A:850 mL纯化水+1.2 g磷酸二氢钠+0.1%磷酸溶解过滤,加入150 m L色谱甲醇混匀;流动相B:乙腈.

表1 A、B流动相在不同时间的比例

2.4 脱盐效果评价

由于在离子交换洗脱液中引入了一定量的氯化钠,为了提高三峡肽素的纯度,本文尝试采用乙醇沉淀法进行脱盐[12].将离子交换洗脱液在55℃旋蒸浓缩后,取1 mL浓缩液加入3 mL无水乙醇,10000 r/min离心5 min,分别测定脱盐前后三峡肽素含量及含盐量.

2.5 洗脱液糖含量分析

为了确定不同离子交换树脂类型对洗脱液中残糖含量的影响,本文采用DNS比色法测定了发酵滤液、发酵滤液离子交换流出液、离子交换洗脱液等不同样品中的残糖含量,详细方法按照包尕红等[13]介绍的方法进行.

2.6 色泽观察方法

采用观察法对溶液色泽进行观察,从观察方式来说,首先用肉眼观察,再用放大镜查看,根据颜色和透明程度来分析色泽,从观察方位来说,一般采用先整体后局部,从左到右的顺序.然后采用对比观察的方法,通过一一比对各个实验结果的色泽,了解不同结果的共性和区别.最后采用动态观察的方法,将每一个样品充分摇匀,辨别摇匀前后的色泽是否发生改变,若溶液呈现均一稳定性,则可以确定色泽.

2.7 统计分析方法

所有实验均设置了3个重复,结果数据以平均数±标准差表示.采用单因素方差分析计算显著性差异,然后进行Duncan多重极差检验.使用Graph Pad Prism 7(Graph Pad Software,Inc.,San Diego,CA)进行统计分析并绘制图表.

3 结果与分析

3.1 不同型号离子交换树脂的选型

为了明确离子交换树脂是否能对三峡肽素进行有效分离,本文选取了大孔型、凝胶型等8种类型的阴阳离子交换树脂进行了初筛.将样品制备好之后,采用初始p H 值(约3.98)、4 BV/h的上样和洗脱流速及0.5 mol/L的氯化钠溶液洗脱,然后收集洗脱液进行含量分析.结果表明,D201型大孔强碱性阴离子交换树脂和732型凝胶强酸阳离子交换树脂的表现明显优于其他类型(见表2),在初始条件下其吸附率接近90%,其收率接近80%,故选用这两种代表性树脂进行后续的分离条件优化研究.

表2 不同离子树脂的初筛效果比较

3.2 732阳离子交换树脂的分离条件优化

为了进一步提高三峡肽素的分离效率,本文首先选择732 型凝胶强酸阳离子交换树脂,探索了上样p H、洗脱p H 及洗脱盐浓度等工艺条件对其吸附率和洗脱率的影响.采用液相测定不同条件下的峰面积作为相对含量,研究发现上样p H 越低,732型凝胶强酸阳离子交换树脂的吸附效果越好,但上样p H 为3.2时的吸附率达到98.41%(如图1(a)所示),故在随后的优化中选择3.2为上样p H 值.而洗脱液p H值对收率的影响正好相反,随着洗脱液p H 值的增加,其收率有一定程度的上升趋势(如图1(b)所示),在p H 值为9时,其洗脱率最高,达到85%以上.

图1 732型凝胶强酸阳离子交换树脂的分离工艺

洗脱液浓度和溶液流速也是影响离子交换效率的重要因素.在其他因素不变的情况下考查了不同氯化钠洗脱盐浓度对洗脱效率的影响,结果表明用0.5 mol/L氯化钠溶液进行洗脱时,其收率稳定在85%以上(如图1(c)所示),考虑到分离效率和随后的脱盐问题,故选择0.5 mol/L 氯化钠溶液进行洗脱.不管是上样流速还是洗脱流速,流速越慢越有利于样品的吸附和洗脱(如图1(d)所示),当上样和洗脱流速均为4 与2 BV/h 时的吸附率和收率相差不大,速度却能大大提升,相同时间能够处理更多的样品,从而获得更多的三峡肽素,2 BV/h的流速过慢,不利于工业化生产,在流速和产量的共同考虑下,优先选择流速为4 BV/h作为分离条件.

3.3 D201大孔强碱性阴离子树脂的分离条件优化

为了提高三峡肽素的分离效率且与732型树脂形成对照,选择D201型大孔强碱阴离子交换树脂,并对其多种工艺条件进行了探索.通过液相测定不同上样p H、洗脱p H、氯化钠浓度下的三峡肽素的相对含量,研究发现上样p H 越高,D201型大孔强碱阴离子交换树脂的吸附效果越好,且上样p H 为10时,其吸附率达到98.04%(如图2(a)所示),故选择10为上样p H 继续优化.然而洗脱p H 对收率的影响刚好相反,随着洗脱p H 值的增加,其收率有显著下降趋势(如图2(b)所示),当洗脱p H 为4时,其洗脱率最高,达到85%以上.考虑到前面732型树脂在上样流速和洗脱流速均为4 BV/h时,三峡肽素的吸附率和洗脱收率较高,故在进行D201型树脂的分离条件优化时,默认选择固定流速为4 BV/h,在上样p H 和洗脱p H 保持不变的情况下,考查了不同氯化钠浓度对洗脱收率的影响,结果表明用0.1 mol/L 氯化钠溶液进行洗脱时,其收率稳定在85%以上(如图2(c)所示).

图2 D201型大孔强碱性阴离子交换树脂的分离工艺

3.4 不同树脂洗脱液的杂质含量分析

经优化后,732 型凝胶强酸阳离子交换树脂和D201型大孔强碱性阴离子交换树脂均可有效分离三峡肽素(图3a),两种树脂的吸附率相差不大,其中阴离子交换树脂的收率略高(见表3),为了进一步比较两种树脂分离三峡肽素的能力,对两种洗脱液的盐离子、残糖及色素等杂质含量进行了处理和分析.由于在离子交换中采用了不同浓度的氯化钠溶液进行洗脱,为了减少终产物中盐离子的含量,尝试了用乙醇进行沉淀脱盐.将洗脱液旋蒸浓缩,然后加入3∶1的无水乙醇进行沉淀,结果发现不管是阳离子型还是阴离子型交换树脂,99%以上的三峡肽素都位于上清液中(表3),这可能与三峡肽素的醇溶性有关[1-2].经阳离子交换树脂吸附后的洗脱液,其脱盐效率接近80%,高于阴离子交换树脂吸附后的洗脱液,说明它更适合用乙醇沉淀法进行脱盐.

图3 洗脱液三峡肽素含量的液相分析及色泽变化

表3 两种树脂洗脱液的效果评价

残糖含量分析表明,经阳离子交换树脂吸附后的洗脱液,其残糖含量很低,原发酵液总糖为26.7 g/L,洗脱后只有0.28 g/L,远低于阴离子型交换树脂(10.35 g/L)(见表3),显示732型凝胶强酸阳离子交换树脂具有极强的吸附糖类物质的能力.同时,在不同的p H 值条件下洗脱时,其色泽有明显的变化趋势,洗脱液p H 值越低,阳离子交换树脂去色素的能力越强,而阴离子交换树脂的去色素能力则越弱(图3(b)).在各自的最佳洗脱条件下(阳离子型p H 为9,阴离子型p H 为4),732强酸性苯乙烯阳离子交换树脂的洗脱液色泽偏浅,说明732强酸性苯乙烯阳离子交换树脂具有更强的色素吸附能力.

4 结 论

三峡肽素作为一种抗菌肽,分子量小.抗菌肽富含亲水的碱性氨基酸残基,末端大多是酸胺化的,具有热稳定性,不易被蛋白酶水解.抗菌肽的正电荷是其结合细菌细胞壁和外膜层的基础.通过调节发酵滤液的p H 值,使其含有的三峡肽素能够吸附在不同类型的离子交换树脂上,三峡肽素为两性化合物,含有可形成正离子的氨基和可形成负离子的羧基.因此,应用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂均可对其进行分离和纯化.通过分析初筛实验数据可知,弱酸阳离子交换树脂和弱碱阴离子交换树脂不适宜分离提取三峡肽素,强酸阳离子交换树脂和强碱阴离子交换树脂较适宜分离纯化三峡肽素,且分离前会将阳离子树脂转化为钠离子型,将阴离子树脂转化为氯离子型.

1)离子交换法可有效分离真菌发酵液中的三峡肽素.D201 大孔强碱性阴离子交换树脂在上样p H为10,洗脱p H 为4,且洗脱盐浓度为0.1 mol/L 时,收率达92.92%.732强酸苯乙烯阳离子交换树脂在上样p H 为3.2,洗脱p H 为9,且洗脱盐浓度为0.5 mol/L时,收率为88.42%.

2)732强酸苯乙烯阳离子交换树脂更适合用于三峡肽素的分离.尽管732强酸苯乙烯阳离子交换树脂的分离效率略低于D201型树脂,但其去杂效果明显优于后者,洗脱液的色素含量低,残糖量更低,采用乙醇沉淀法脱盐的效果更优.

3)实验阶段采用的层析柱长度可能影响普适性,后面将基于离子交换树脂分离的优化条件进一步放大,且会继续探究大孔强碱性阴离子树脂对三峡肽素进行分离提取时的最佳流速.

综上,采用732强酸苯乙烯阳离子交换树脂来大规模分离草酸青霉发酵液中的三峡肽素是可行的.