黄芩素对黄药子致肝损伤模型小鼠的防护作用及其机制*

朱舒虹，任翠翠，王 冉，段石顽，谢允东

（1.陕西省西安市第一医院，陕西 西安 710002； 2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）

黄药子为薯蓣科薯蓣属黄独Dioscorea bulbiferaL.的地下块茎，在我国分布广泛，药用历史悠久［1-2］。黄药子及其制剂用于治疗甲状腺肿大、肿瘤等效果较好，但会引发肝损伤等不良反应［3］。研究发现，肝损伤主要是由二萜内酯类化合物在肝脏蓄积诱发氧化应激反应导致［4-5］。核因子E2 相关因子2（Nrf2）在肝脏组织中高度表达，在氧化应激的作用下，Nrf2 被激活，通过抗炎、抗氧化和调控细胞凋亡等机制，抑制核因子-κB（NF-κB）的激活，是肝损伤防护作用中重要的内源性抗氧化信号通路［6］；且其下游的药物转运体表达上调，加速肝脏中的药物及其代谢物的转运排泄。中药黄芩具有保肝作用，与黄药子配伍能减轻后者的肝毒性［7］。黄芩素是黄芩的主要活性成分，对四氯化碳、半乳糖胺、对乙酰氨基酚、卡介苗+ 脂多糖等诱导的肝损伤具有防护作用。基于此，本研究中探讨了黄芩素对黄药子致肝损伤模型小鼠的防护作用及其机制，为黄芩配伍黄药子的临床安全应用提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药及动物

仪器：DYY-7C型电泳仪（北京六一仪器厂）；ELX-800 型酶标仪（美国Bio Tek 公司）；EXICYCLER 96 型荧光定量PCR 仪（韩国Bioneer 公司）；DP73型显微镜拍照系统（日本Olympus公司）。

试药：黄芩素（批号为E0804550250，含量≥98%）、水飞蓟素（批号为D110160，含量≥98%），均购自安耐吉＜上海＞医药化学有限公司；黄药子饮片（陕西兴盛德药业有限责任公司，批号为20210610）；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（批号为20211012），丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（批号为20211112），碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（批号为20211212），总胆红素（TBiL）试剂盒（批号为20211216），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号为20211016），过氧化氢酶（CAT）试剂盒（批号为20211112），谷 胱 甘 肽（GSH）试 剂 盒（批 号 为20211116），丙二醛（MDA）试剂盒（批号为20211218），均购自南京建成生物工程研究所；Nrf2 抗体（批号为WL012135），核 因 子（NF）- κB p65 抗 体（批 号 为WL01273b），磷酸化NF - κB p65（p - NF - κB p65）抗体（批号为WL012169），血红素加氧酶1（HO - 1）抗体（批号为WL02400），肿瘤坏死因子- α（TNF - α）抗体（批号为WL01581），白细胞介素6（IL-6）抗体（批号为WL02841），β-actin 细胞抗体（批号为WL01372），组蛋白H3 抗体（Histone H3）抗体（批号为WL0984），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（二抗，批号为WL023），全蛋白提取试剂盒（批号为WLA019），核蛋白和浆蛋白提取试剂盒（批号为WLA020a），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号为WLA004），BeyoRT ⅡM - MLV反转录酶（批号为D7160L），均购自沈阳万类生物科技有限公司；苏木素（H，批号为H8070）、伊红（E，批号为A600190），均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

动物：健康SPF 级KM 小鼠60 只，雄性，体质量（20±2）g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物合格证号0043206，实验动物生产许可证号SCXK（川）022 - 030。动物实验经陕西中医药大学动物伦理委员会批准（批准号SUCMDL20220304009），实验动物使用许可证号SYXK（陕）2017-004。饲养于陕西中医药大学SPF 级实验室中，相对湿度45%～65%，温度22～24 ℃，12 h/12 h明暗交替。

1.2 方法

黄药子醇提物制备：取药材饮片样品细粉适量，加10倍体积的75%乙醇加热回流提取3次，每次4 h，合并3 次提取液，减压浓缩蒸干，得到固体，用研钵研匀，备用。

分组、建模与给药：将60 只KM 小鼠随机分为正常对照组［A组，等体积0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液］，模型组（B 组，等体积0.5%CMC-Na 溶液），水飞蓟素组（C 组，200 mg/ kg），黄芩素高、中、低剂量组（D1组、D2组、D3组，10，5，2.5 mg/kg），各10 只。灌胃黄药子醇提物（3 g/kg），每日上午1 次，连续14 d，以复制肝损伤小鼠模型，同期（每日下午）各组小鼠灌胃相应药物或0.5%CMC-Na 溶液。末次给药结束后，禁食不禁饮12 h。

1.3 观察指标

体质量、肝脏质量与肝脏系数：称定小鼠体质量。眼眶取血后，取肝脏组织，置生理盐水中去除血块及结缔组织等，用吸水纸吸干表面的水分，称定肝脏质量。计算肝脏系数（肝脏质量与体质量的比值）。

肝脏组织病理检查：取小鼠肝脏组织，剪取一部分固定于4%多聚甲醛溶液中，3 d 后进行石蜡包埋、切片及HE染色，显微镜下观察并拍照。

生化指标：眼眶取血，4 ℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液。采用试剂盒说明书方法分别测定肝功能指标AST，ALT，ALP，TBiL 水平及抗氧化指标SOD，CAT，GSH，MDA水平。

Nrf2蛋白调控的下游药物转运体mRNA水平：取小鼠肝脏组织，加入TRIpure 裂解液，充分混匀，室温静置5 min，加入氯仿，混匀，室温静置3 min，取水相，加入等量异丙醇，-20 ℃下过夜，12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入75%乙醇，4 080 r/min 离心3 min，弃上清，加入RNase-free 双蒸水，室温放置2 min，充分混匀，待沉淀完全溶解，得样本总RNA，采用紫外-可见分光光度法测定RNA 浓度。采用反转录聚合酶链反应将样本总RNA 反转录为cDNA，加入Nrf2蛋白调控的下游药物转运体多药耐药相关蛋白2（MRP2）、P-糖蛋白（P-gp）、胆酸盐外排泵（BSEP）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）基因引物，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）法检测上述基因的mRNA水平。

蛋白表达水平：采用Western blot法。取小鼠肝脏组织，液氮研磨，加入蛋白裂解液，研成匀浆，冰上静置5 min，4 ℃、12 000 r / min 离心10 min，分离蛋白质抽提物。采用BCA 法进行蛋白质定量，经SDS - PAGE，转膜，封闭，用5%脱脂奶粉稀释p - NF - κB p65，NF-κB p65，TNF-α，IL-6，Nrf2，HO-1等一抗，稀释比例为1∶500，4 ℃下孵育过夜，浸入TBST 缓冲液中，用5%脱脂奶粉稀释二抗，稀释比例为1∶5 000，37 ℃下孵育45 min，采用电化学发光法在暗室中显影，扫描胶片，分析目标条带的光密度值；同时提取细胞核Nrf2（Nuc-Nrf2）蛋白，同时测定光密度值。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；绘制柱状图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量、肝脏质量及肝脏系数

与A 组比较，B 组小鼠体质量显著降低，肝脏质量与肝脏系数均显著升高（P＜0.05）。与B 组比较，C 组、D1组小鼠肝脏质量均显著降低，C 组、D1组、D2组、D3组小鼠的肝脏系数均显著降低（P＜0.05）。详见图1。

a.体质量 b.肝脏质量 c.肝脏系数注：与A组比较，#P ＜0.05；与B组比较，*P ＜0.05。图3至图6同。图1 小鼠的体质量、肝脏质量、肝脏系数（±s，n=10）a.Body mass b.Liver mass c.Liver coefficientNote：Compared with those in the group A，#P ＜0.05.Compared with those in the group B，*P ＜0.05（for Fig.1 and Fig.3 - 6）.Fig.1 Body mass，liver mass and liver coefficient of mice（±s，n=10）

2.2 肝脏组织病理形态

A 组小鼠的肝细胞排列整齐，边界清晰，细胞形态与结构正常；B组小鼠肝细胞结构紊乱，边缘模糊，界限不清，出现水肿及炎性因子浸润，部分肝细胞核出现溶解；C 组小鼠肝细胞损伤得到好转；D1组、D2组、D3组小鼠的肝细胞形态与结构有好转，且随着剂量的增加，改善作用明显增强。详见图2。

图2 小鼠肝脏组织病理形态（HE，×400）Fig.2 Pathological morphology of liver tissue of mice（HE，× 400）

2.3 肝功能指标

与A 组比较，B 组小鼠的AST，ALT，TBiL 水平均显著升高（P＜0.05）；与B 组比较，C 组、D1组、D2组小鼠的AST，ALT，TBiL 水平均显著降低（P＜0.05）。详见图3。

a.AST b.ALT c.TBiL d.ALP图3 小鼠肝功能指标（±s，n=10）a.AST b.ALT c.TBiL d.ALPFig.3 Liver function indexes of mice（±s，n=10）

2.4 抗氧化指标

与A组比较，B组小鼠的MDA水平显著升高，SOD，CAT，GSH 水平均显著降低（P＜0.01）；与B 组比较，C 组、D1组小鼠的MDA 水平显著降低，C 组、D1组、D2组小鼠的SOD，CAT 水平均显著升高，D3组小鼠的SOD 水平显著升高（P＜0.05）。详见图4。

a.SOD b.CAT c.GSH d.MDA图4 小鼠抗氧化指标（±s，n=10）a.SOD b.CAT c.GSH d.MDAFig.4 Antioxidant indexes of mice（±s，n=10）

2.5 Nrf2 下游药物转运体mRNA 水平

与A 组 比较，B 组 小鼠 的MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 水平均显著降低（P＜0.05）；与B 组比较，C 组、D1组、D2组 小 鼠 的MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA均显著升高（P＜0.05）。详见图5。

a.MRP2 b.P-gp c.BSEP d.UGT1A1图5 小鼠Nrf2下游药物转运体mRNA水平（±s，n=10）a.MRP2 b.P-gp c.BSEP d.UGT1A1Fig.5 mRNA levels of Nrf2 downstream drug transporters of mice（±s，n=10）

2.6 蛋白质表达水平

与A组比较，B组小鼠的细胞核Nrf2，HO-1蛋白的表达水平均显著降低，p-NF-κB p65，TNF-α，IL-6蛋白的相对表达水平均显著升高；与B组比较，C组、D1组、D2组、D3组小鼠前2种蛋白的表达水平均显著升高，后3种蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05）。详见图6。

3 讨论

黄芩素是黄芩发挥保肝作用的有效成分，属黄酮类化合物，具有显著的抗氧化和抗炎作用，对四氯化碳、半乳糖胺、对乙酰氨基酚及卡介苗加脂多糖所致肝损伤具有显著的防护作用。本研究中，黄芩素干预后，细胞核Nrf2表达上调，NF-κB p65磷酸化过程被抑制，提示黄芩素可激活Nrf2/NF - κB 通路，启动其下游的相关抗氧化蛋白的表达，抑制相关炎性因子的表达。Nrf2/ NF - κB 信号通路是肝损伤防护的有效途径［8-10］。本研究中，B 组小鼠的细胞核Nrf2 蛋白表达水平，SOD，CAT，GSH 水平均显著低于A 组，MDA 水平，p - NF - κB p65，TNF - α，IL - 6 蛋白表达水平均显著高于A组，提示黄药子诱导的肝损伤模型小鼠发生了严重的氧化应激反应和炎性反应。B 组小鼠肝细胞中，Nrf2 蛋白调控的下游药物转运体MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 表达水平均显著低于A 组，提示肝损伤模型小鼠转运黄药子提取物及其代谢物的量相对减少，易产生药物蓄积损伤肝脏。

本研究中，与B 组比较，D1组、D2组、D3组小鼠的SOD，CAT，GSH 水平均显著升高，MDA 水平显著降低，TNF- α 和IL- 6 蛋白表达水平均显著降低，提示黄芩素对黄药子诱导的氧化应激与炎性反应具有改善作用。本研究中，黄芩素干预后，D1组、D2组、D3组小鼠的细胞核Nrf2 蛋白表达显著下调，肝细胞中药物转运体MRP2，P-gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 水平均显著升高；且Nrf2 蛋白激活后诱导下游的转运体转录，对于减轻药物性肝损伤具有重要作用［11-16］，提示黄芩素对黄药子诱导的小鼠肝损伤具有防护作用可能与激活Nrf2/ NF - κB 信号通路及其下游的药物转运体有关。AST，ALT，ALP，TBiL 是临床诊断肝功能损伤的常用指标［17］。B 组小鼠的AST，ALT，TBiL 指标较A 组显著均升高，提示B 组小鼠肝脏细胞出现了损伤坏死；D1组、D2组、D3组小鼠的上述指标水平均显著低于B 组，提示黄芩素能改善小鼠肝损伤。该检测结果与肝脏组织病理形态观察结果相符。

综上所述，黄芩素对黄药子诱导的肝损伤有一定防护作用，其作用机制可能与通过Nrf2/NF - κB 信号通路，激活其下游的转运体及提高抗氧化、抗炎水平有关。