大鲵活性物质构效关系研究进展

刘金洋，翟兴月，罗 婵，陈 平，李 伟，，佟长青

（1.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023；2.大连医科大学附属第二医院临床营养科，辽宁大连 116023；3.长沙金驰科研有限公司，湖南长沙 410000）

0 引言

大鲵（Andrias davidianus），又名娃娃鱼，属隐鳃鲵科，是我国特有的珍稀动物。大鲵作为一种传统的药用动物，其肌肉、皮肤、骨骼均可食用、入药。中医认为大鲵性甘平，可补气益血、滋阴补肾[1]。大鲵具有极高的经济价值，在食用、医疗、保健等方面具有广阔的开发前景，各界颇为关注。为了探究大鲵体内的营养成分，已有研究对大鲵的各个部位进行了分析。研究发现大鲵体内含有蛋白质、氨基酸及脂肪酸等多种营养成分[2]。多不饱和脂肪酸可预防心脑血管疾病，提高脑细胞活性，增强记忆力和思维能力[3]。大鲵肌肉和尾脂中含有大量脂肪，其中多种不饱和脂肪酸的含量大于70%[4-5]，除以上营养成分外，大鲵还含有胶原蛋白、糖肽、活性肽和透明质酸等多种功能性成分，具有调节免疫力、抗氧化性、抗疲劳、抗癌及降血糖等作用[6-7]。

研究发现，低分子量抗氧化肽的活性更强，与其亲本蛋白质相比，分子量较低的肽更容易靠近自由基，从而抑制自由基介导的脂质氧化[8]。Yi-ping Y等人[9]在对莲子蛋白水提物的研究中发现，分子量最低组分肽的抗氧化活性明显强于分子量高的组分。此外，氨基酸组成对生物活性的影响也很重要。序列中疏水氨基酸的含量高则抗氧化活性较强；序列中的酸性氨基酸和碱性氨基酸可以螯合金属离子展现高抗氧化活性[10]。部分抗菌肽含有亲水与疏水2 种基团，二者相互作用可影响抗菌活性，亲水基团易与水结合，疏水基团则易与脂质结合，从而保证抗菌肽与细胞膜更好的结合，从而导致细胞膜解体使细菌死亡[11]。二级结构与多肽的抗菌活性也存在关联，主要分为α 螺旋型、β 折叠型、环形及伸展性螺旋结构类，不同二级结构对抗菌肽的影响各有差异[8]。

为充分利用养殖大鲵资源，使其在医疗、保健、食品等领域充分发挥功效，对大鲵功能性成分的深入研究十分必要。目前，有许多研究者对大鲵体内的活性成分及其功效进行了研究，对大鲵胶原蛋白、活性肽、脂肪及透明质酸等活性物质构效关系的研究进行综述，以期为大鲵活性物质构效关系的深入研究和大鲵精深加工产品研发提供一定的参考。

1 活性物质构效关系研究现状

1.1 胶原蛋白与明胶

胶原蛋白广泛应用于化妆品、保健品、医疗等方面。胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白，包含一个或多个胶原蛋白三螺旋构象的结构域，三螺旋结构由3 条多肽链组成，其氨基酸序列由Gly-X-Y 重复序列组成。目前，胶原蛋白主要来源于陆生动物，由于疾病的产生，导致陆生动物胶原蛋白存在风险[12-13]。因此，从水产动物中提取胶原蛋白具有低抗原性、高生物相容性及高生物降解性，可作为陆生动物胶原蛋白的替代来源[14]。大鲵皮中胶原蛋白含量为28.86%，是提取胶原蛋白的良好原料[15]。大鲵胶原蛋白具有三股螺旋结构及2 种不同的α 链（α1、α2），属于I 型胶原蛋白[16]。杨碧仙等人[17]研究发现大鲵皮胶原蛋白对DPPH·和·OH 有较好的清除作用，IC50值分别为9.96，7.79 mg/mL，具有较好的抗氧化能力。将大鲵皮胶原蛋白酶解后，发现胶原蛋白和胶原蛋白肽均具有三股螺旋结构，且同样具备抗氧化能力[16]，三股螺旋结构中含有肽链间的活性基团形成的氢键，从而保证抗氧化能力的稳定发挥[16-18]。因此，大鲵胶原蛋白及其水解肽的抗氧化性与其特殊的三股螺旋结构有关。

明胶是一种可溶性胶原蛋白化合物，其结构与胶原蛋白相近[19]。利用热水浸提法从大鲵皮中提取的明胶中Gly、Pro、Glu 和Ala 的含量相对较高[20]，疏水氨基酸的含量越高，抗氧化活性越强[10]。酶解大鲵明胶后发现，在样品质量浓度为6.99 mg/mL 条件下，大鲵明胶肽对DPPH·的清除率为50%[21]。从氨基酸组成和结构上看，胶原蛋白与明胶均含有疏水性氨基酸且为三股螺旋结构，使其具有一定的自由基清除能力。

1.2 透明质酸

透明质酸，也称玻尿酸，是一种非硫酸化的糖胺聚糖，其双糖单元由N- 乙酰-D- 葡萄糖胺与D-葡萄糖醛酸构成，具有三级网状结构[22]。透明质酸由细胞膜上的膜蛋白合成，是多种细胞组织的重要组分，透明质酸具有抗氧化活性[23]。高瑞昌等人[24]通过酶解法制备罗非鱼眼透明质酸，发现透明质酸分子量越低，其DPPH·的清除能力及还原力越强。于海慧等人[25]通过酶解法提取大鲵黏液中的透明质酸，其分子量为4.85×106Da，可体外清除·OH、DPPH·和ABTS+·、还原Fe3+，具有一定的抗氧化能力。此前有研究表明，胶原蛋白对DPPH·的清除率为52.6%，将分子质量为1～10×104U 的透明质酸与胶原蛋白按2∶8 复配后，其对DPPH·清除率明显提高，最高值为76.4%[26]。透明质酸在与大鲵活性肽形成组合物后，大鲵活性肽对ABTS+·清除率显著提高，但对DPPH·清除率无显著影响，由于2 种方法使用的溶剂不同，DPPH·使用乙醇溶解，而ABTS+·使用水溶解，水溶液的环境下，大鲵活性肽可利用透明质酸的三级网状结构，从而提升其抗氧化性[27]。

1.3 脂肪

大鲵脂肪中的不饱和脂肪酸不仅具有抗氧化、降血脂及预防心血管疾病等功效，还可以有效治疗烫伤和烧伤[28]。人体无法合成二十碳五烯酸（Timnodonic acid，EPA） 与二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），二者均是必需脂肪酸，是ω-3 长链多不饱和脂肪酸和α- 亚麻酸的代谢产物[29]。DHA 和EPA 具有良好的降血压和抗心脑血管疾病的作用[30]。王苗苗等人[31]利用酶解法从大鲵尾部提取的脂肪酸品质较好，EPA 和DHA 总量较高，证明大鲵油具有预防心血管疾病的作用。王寒等人[32]证明了大鲵尾部油脂具有一定的抗氧化能力。较低的ω-6/ω-3多不饱和脂肪酸构成比可以改善高脂喂养大鼠脂肪代谢与抗氧化能力[33]。大鲵尾部油脂脂肪酸中ω-6/ω-3多不饱和脂肪酸构成比为2.45∶1[31]。李良玉等人[34]在对小米油抗氧化活性研究中发现，小米油中主要脂肪酸为棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、花生酸和亚麻酸。罗秦等人[35]对粗大鲵油精制后，利用气相色谱法共检测出25 种脂肪酸，其中主要的脂肪酸为油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、DHA、硬脂酸和α - 亚麻酸。小米油和大鲵油中不饱和脂肪酸含量较高，且不饱和脂肪酸组成相似。由此推断，大鲵尾部油脂抗氧化性与其脂肪酸中ω-6/ω-3 多不饱和脂肪酸构成比有关与不饱和脂肪酸含量及组成有关。

1.4 活性肽

1.4.1 低聚糖肽

大鲵体表黏液是大鲵低聚糖肽的主要来源，低聚糖肽中蛋白和糖通过O- 或N- 糖肽键连接，含量分别为80.01%和15.15%[36]。低聚糖肽中的糖包括氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和唾液酸[37]。大鲵低聚糖肽含有多种氨基酸，其中Thr、Glx、Asx 的含量较高，Ser 含量最低，因水解过程中Trp 被破坏而未被检出[38]。大鲵低聚糖肽具有抑制肿瘤生长、自由基清除自由基、免疫调节作用等多种生物功能[39-40]。有研究制得了分子量小于4000 Da 的大鲵低聚糖肽，其糖链通过N- 乙酰半乳糖胺通过O- 糖肽键连接到Ser 或Thr 上，具有-Galβ1-3GalNAcα-O- Ser/Thr 结构[41]，存在O- 糖肽键的糖肽具有免疫活性，大鲵低聚糖肽中存在O- 糖肽键，这与制得的-Galβ1-3Gal NAcα-O-Ser/Thr 结构存在关联。

1.4.2 抗氧化肽

自由基是生物在体内正常反应产生的不稳定、极易与其他分子发生反应且具有强氧化性的物质[42]。任何过量的自由基都会导致细胞损伤，进而引发动脉粥样硬化、关节炎、糖尿病和癌症等疾病。疏水性氨基酸（如Met、Trp、Phe 等） 会影响肽的抗氧化活性[43]。若多肽的N- 端含有某些疏水氨基酸（Val、Leu），则抗氧化活性较强，若多肽序列C- 端相邻氨基酸残基为疏水性低的氨基酸，则多肽的抗氧化性将会增强[44]；一些含有碱性氨基酸残基（His、Lys）和主要包含酸性氨基酸残基（Glu、Asp） 的多肽同样具有较强的抗氧化活性[45]。Li Y W 等人[46]研究发现，多肽的抗氧化活性主要与N- 端氨基酸残基与中心氨基酸有关，若N- 端氨基酸残基是高疏水、低电子的氨基酸（如Ala、Gly、Val、Leu），中心氨基酸是高氢键特性氨基酸（如碱性氨基酸），则多肽抗氧化活性较强。还有研究发现，肽链中存在Gly 的重复序列可使多肽中形成更多的分子内氢键，使其抗氧化活性增强[47]，与Li Y W 等人[46]的研究结果存在相似之处；此外，芳香族氨基酸（Tyr 和Phe） 可通过电子转移使活性氧保持稳定；His 和Met 的存在也可以增强多肽的抗氧化活性[48]。大鲵多肽在体外抗氧化模型中表现出较好的抗氧化能力[49]，李伟等人[50]从大鲵肉中酶解得到的活性肽具有显著的抗氧化活性，检测出氨基酸序列为HDCDLLR 和LEAQSRPFDAK 的2 条肽链中存在多个疏水氨基酸和碱性氨基酸，与上述研究结果中对于疏水氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸的存在可增强多肽的抗氧化活性有一定的关联。胡廷等人[49]研究发现大鲵酶解物4 个超滤组分中ADPP-I 对·O2-和·OH 的清除效果好于大鲵活性肽，其主要氨基酸为Glu 和Asp，二者皆为酸性氨基酸，酸性氨基酸的电子可抑制自由基[10]，所以抗氧化活性较好。且有研究表明，C- 端相邻的氨基酸残基为疏水性较低的氨基酸（Arg、Glu、Asp 等） 的多肽抗氧化活性较强。此外，ADPP-I 中还检测出大量酸性氨基酸和芳香族氨基酸[52]。由此表明，ADPP-I 抗氧化性与氨基酸组成有关。

1.4.3 抗菌肽

抗菌肽广泛存在于生物体内，是天然存在的免疫应答物质，可选择性作用于微生物并将其降解成小分子物质。抗菌肽与细菌的细胞膜之间的相互作用可破坏细菌的脂质双分子层，使细胞膜解体从而导致细菌死亡[53]。任婷等人[54]对大鲵血源抗菌肽Andricin B 的氨基酸组成进行分析，其中带有Lys 和Arg，二者皆为正电荷氨基酸残基，并且不含负电荷氨基酸，表明该抗菌肽为正电荷型抗菌肽。这些研究结果表明阳离子型氨基酸可以影响抗菌肽的活性。此外抗菌肽的疏水性也有助于其插入细胞膜，与细胞膜相互作用，疏水性增强可提高抗菌活性，可帮助抗菌肽进入细菌细胞影响其正常代谢，最终杀死细菌[55]。大鲵血源抗菌肽Andricin B 与大鲵皮肤抗菌肽Andricin 01 均为疏水性多肽，二级结构皆为无规则卷曲结构[54-56]。李伟等人[41]提取的大鲵低聚糖肽抗菌效果显著，经高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）检出该抗菌肽含有17 种氨基酸，其中Asx、Thr、Glx、Pro、Leu 含量较高，富含疏水氨基酸（如Pro、Leu 等）。由此可见，阳离子型、疏水性和无规则卷曲结构与抗菌效果存在联系。

目前，对于多肽生物活性构效关系的研究主要集中于氨基酸组成和多肽序列方面，对于肽链的结构、肽链长短对多肽的生物活性的影响程度并未进行更深入的探讨，若能充分掌握大鲵活性肽的影响因素，未来在活性肽制备方面不仅可以采用化学水解和酶水解等常用的方法，还可以通过化学合成法精准制备出所需要的活性肽。

1.5 色素

杨慧等人[57]采用碱溶- 酸提取法提取大鲵皮肤黑色素，发现大鲵皮肤黑色素由真黑色素和脱黑色素2 种色素组成。真黑色素是由5,6- 二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA） 黑色素和5,6- 二羟基吲哚(DHI)黑色素聚合而成，脱黑色素是由2-S- 半胱氨酸和5-S-半胱氨酸聚合脱羧形成[57]。进一步研究其功能性，发现大鲵皮肤色素对·O2-的清除效果较强，底物浓度相同时，清除强度明显高于维C（Vitamin C，VC），但对·OH 的清除率却明显低于维C[58]。有研究证明，羧酸和酚类的O-H 伸缩振动与其清除自由基和金属螯合能力有关，进而有助于减缓脂质氧化过程[59]。由此推测，大鲵皮肤黑色素的抗氧化性与其结构中的羧酸和酚类有关。

2 结语

近年来，大鲵活性物质的制备、组成、结构及生物活性的研究已取得了一定进展。现已发现大鲵活性物质具有抗菌、抗氧化和免疫调节等多种作用。大鲵活性物质的生物活性主要受分子量大小和分子结构的影响。组成及结构研究是探究生物活性的前提，但目前对大鲵抗肿瘤、抗疲劳和降血糖等其他生物活性的构效关系尚不明确，不利于大鲵活性物质精加工的发展。目前，大鲵活性物质的体内研究较少，在投入市场前，应明确所研究物质的生物活性在生物体内是否有所改变。对于其他活性构效关系的仍为空白，应更加深入研究大鲵其他活性的构效关系，可以从已经发现的其他来源活性物质的构效关系的研究角度进行研究。明确活性物质的各种生物活性的组成及结构后，便可为发现新的生物活性、合成目标产物及工作机理的研究奠定基础。影响活性物质功能性的因素有分子质量、组成及结构特征等，活性物质的提取方法与所得产物的结构与功能息息相关。