牛轮状病毒HSX-21内蒙株的分离鉴定与基因型分析

徐晓静，谢梦圆，陈柯佳，杜立廷，尚和卫，常继涛，周伟光，王建龙

（1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 150069；3.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心，呼和浩特 010018）

牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）是呼肠孤病毒科，轮状病毒属的成员[1]，轮状病毒包含7个不同的群（A～G）。众多研究表明A群轮状病毒是引起犊牛腹泻的主要病原，以7日龄以内的犊牛最易感，成年牛多呈隐形感染，牛群一旦发生本病，随后将每年连续发生，这是由于轮状病毒在动物体外具有较强的抵抗力[2]，并且隐形感染的牛可持续排毒的缘故。腹泻是本病的主要症状，患病牛主要发病症状为腹泻，精神萎靡，食欲不振，严重者可排出带血液和黏液的稀粪，部分病牛会因为严重脱水和酸碱平衡失调而死亡，发病率最高可达90%～100%[3]，给养牛业造成了巨大的经济损失。

轮状病毒基因组由包裹在三层病毒颗粒中的11个双链核糖核酸片段组成，VP6（viral protein 6）是重要的群抗原，根据该抗原的不同可将轮状病毒分为不同的群及亚群；轮状病毒外衣壳蛋白VP4（viral protein 4）是由第4 RNA节段编码，VP7（viral protein 7）的编码基因因毒株而异，由第7、8或第9 RNA节段编码[4]，二者引发中和抗体反应，并构成G（VP7）型和P（VP4）型双重分类系统的基础，因此RV被分为G型（VP7，糖蛋白）P[X]（VP4，蛋白酶敏感）[5]，根据牛轮状病毒VP7和VP4序列分析比对可确定血清群G基因型和P基因型，目前全球流行的主要牛轮状病毒为G6、G8和G10型，而我国流行的主要牛轮状病毒为G6和G10型，该病毒常与其他病原混合感染，目前尚无有效的治疗药物和疫苗[1,6]。本研究分离得到一株BRV，并对其外衣壳蛋白（VP7、VP4）的基因型进行遗传进化分析，为内蒙古地区BRV的防控和致病机理的研究提供理论基础和技术储备。

1 材料和方法

1.1 细胞、病料来源及试剂MA-104细胞由金宇保灵生物药品有限公司惠赠；病料来自内蒙古自治区呼和浩特市某牛场采集的犊牛腹泻粪样，RT-PCR检测的BRV阳性样品；RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA marker、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase、反转录试剂均购自TaKaRa公司；DMEM、PBS、0.25%胰酶均购自Gbico 公司。

1.2 病毒的分离取检测为阳性的腹泻粪便用PBS稀释，4℃条件下6500 ×g离心5 min，用0.22 µm滤膜过滤上清液，加入终浓度为30 µg/mL的胰酶37℃水浴1 h，接种至PBS润洗过的MA-104，37℃孵育1 h，弃掉上清液，加入胰酶终浓度为5 µg/mL的DMEM培养基，待出现明显细胞病变，-80℃冻融3次收集病毒液。

1.3 分离毒株TCID50测定将分离得到的含病毒的细胞培养液上清液进行10倍梯度稀释，将10-1～10-10共10个梯度的稀释液接种于单层MA104细胞，每个稀释度接种8孔，接毒量100 µL/孔，同时设置正常对照，37℃、5% CO2培养箱培养5 d，按Reed-Muench法计算TCID50。

1.4 核酸提取与基因型鉴定按照RNA提取试剂盒说明书和反转录试剂盒说明书对病毒液进行RNA提取及反转录。引物设计参考文献[10]于生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用VP7-F和VP7-R引物进行BRVVP7全长基因的扩增，再以VP7全长基因的产物作为模板，用VP7-F和VP5-R、VP6-R、VP8-R、VP9-R和VP10-R引物分别进行多重半套式RT-PCR，鉴定G型。

1.5 测序及序列分析将分离毒株于上海凌恩生物科技有限公司进行全基因组测序。测序结果于NCBI BLAST进行序列比对，下载GenBank中国内外公布的VP6、VP7和VP4参考序列，使用MEGA 6软件将序列进行比对及同源性分析，用最大似然法构建遗传进化树。

2 结果

2.1 病毒的分离及鉴定将RT-PCR检测为阳性的病料接种至MA104细胞后，分离得到一株出现细胞病变的BRV，命名为HSX-21。如图1所示细胞病变主要表现为细胞内颗粒增多，细胞肿大，皱缩，集聚，出现空泡等。

图1 分离株于23 h在MA104细胞上的病变Fig.1 Pathological changes of the isolated strain on MA104 at 23 h

2.2 分离毒株TCID50的测定将含病毒的上清液作10倍梯度稀释接种于单层MA104细胞的96孔板中，连续观察5 d，经Reed-Munch法计算TCID50，测定的HSX-21分离株的毒价为1×105.427TCID50/0.1mL。

2.3 PCR扩增结果将分离的毒株（HSX-21）传代至F7代，提取核酸为模板，如图2所示，通过VP7多重半套式RT-PCR扩增出500 bp的G6型特异性核苷酸条带，表明HSX-21是一株G6型轮状病毒。

图2 G型扩增结果Fig.2 G-type amplification results

图3 HSX-21 VP6基因遗传进化树Fig.3 Genetic evolution tree of HSX-21 VP6 gene

图4 HSX-21 VP7基因遗传进化树Fig.4 Genetic evolution tree of HSX-21 VP7 gene

图5 HSX-21 VP4基因遗传进化树Fig.5 Genetic evolution tree of HSX-21 VP4 gene

2.4 HSX-21基因型分析

2.4.1VP6基因分析 轮状病毒A～G群的基因型由VP6决定，若序列比对同源性大于80%可认为属于同一基因型，通过MEGA软件的ClustalW方法将HSX-21分离株与国内外不同地区分离的轮状病毒毒株的VP6核苷酸序列进行比对分析，HSX-21VP6基因序列与轮状病毒株NCDV（JF693031.1，美国1971）同源性最高，为99.7%，遗传进化分析显示，HSX-21和BRV105（AB748568.1，日本1983）亲缘性最为相近。

2.4.2 BRVVP7基因分析 BRV G基因型由VP7决定，若序列比对同源性大于80%可认为属于同一基因型，通过MEGA软件的ClustalW方法将HSX-21分离株与国内外不同地区分离的轮状病毒毒株的VP7核苷酸序列进行比对分析，遗传进化分析显示，HSX-21与牛源轮状病毒毒株（G6）核苷酸同源性均高于80%，因此内蒙古分离株HSX-21基因型为G6型，其中HSX-21株VP7基因与轮状病毒株RF（MT240633.1，英国2013）的同源性最高，为99.7%，根据系统进化分析HSX-21和HLJ3409（MT240632.1，中国2017）、NMG17048（MT240637.1，中国2017）和HLJ8002（MT240633.1，中国2017）亲缘性相近。

表2 HSX-21分离株与参考毒株的核苷酸序列同源性（%）Table 2 Nucleotide sequence identity of the rotavirus HSX-21 strain compared with the reference rotavirus strains (%)

表3 HSX-21分离株与参考毒株的核苷酸序列同源性（%）Table 3 Nucleotide sequence identity of the rotavirus HSX-21 strain compared with the reference rotavirus strains (%)

2.4.3 BRVVP4基因分析 BRV P基因型由VP4决定，若序列比对同源性大于80%可认为属于同一基因型，通过MEGA软件的Clustal W方法将内蒙古分离株与国内外不同地区分离的轮状病毒毒株的VP4核苷酸序列进行比对分析，遗传进化分析显示，HSX-21与牛源轮状病毒毒株（P[1]型）核苷酸同源性均高于80%，由此得知内蒙古分离株HSX-21基因型为P[1]型，其中HSX-21株VP4基因与轮状病毒株NMG17044（MN807286.1，中国2017）的同源性最高，为98.8%，HSX-21毒株与CHLY（FJ969816.1，中国2009）亲缘关系更接近。

3 讨论

牛腹泻是严重危害养牛业的重要疾病之一，引起腹泻的病因是多因素的，轮状病毒是引起牛腹泻病的主要病原之一，因死亡率增加、治疗费用增加和体重增加减少给内蒙古养牛业带来重大经济损失。牛源轮状病毒已鉴定出至少属于12种G型（G1-3、G5、G6、G8、G10、G11、G15、G17、G21和G24）和11种P型（P[1]、P[3]、P[5-7]、P[11]、P[14]、P[17]、P[21]、P[29]和P[33]）。G6和G10型轮状病毒是BRV的主要血清型，栾婧婧等[7,8]从犊牛腹泻病料在MA104上盲传4代出现细胞病变，分离到一株RV（CHLY），对其VP7的序列分析结果表明CHLY与G6血清型轮状病毒RF株同源性高，核苷酸同源性为98.9%，表明分离的轮状病毒CHLY株为G6型轮状病毒，说明G6型BRV已在我国流行；李然等[9]分离得到一株基因型为G6P[11]型的牦牛源BRV；常继涛等[10]对全国5个省份的90份犊牛腹泻粪便样品进行轮状病毒病原检测，共检出11份轮状病毒阳性样品，均来源于内蒙古和新疆，阳性样品经VP7多重半套式RT-PCR 鉴定，其中4份样品为G6型；王鑫等[11]在黑龙江省齐齐哈尔市某养殖场获得一份犊牛腹泻粪便，分离到G6P[1]型RV毒株。目前，BRV呈全球性分布，各国均有报道[12-13]。随着各国养牛业的大力发展及进、出口牛只的增多，BRV 流行株的基因型也呈多样化，一些来自其它哺乳动物重配毒株也在牛群中被发现，2011年在韩国牛群中发现的人、牛、猪重配毒株 G8P[7]、G6P[7]型RV，其中1～9个片段来源于猪/人的RV[14]；Abe等[15]从日本牛场中分离鉴定了两株新的牛轮状病毒AzuK-1（G21P[29]）和Dai-10（G24P[33]），阿根廷猪群中也检测到牛源的G6P[1]菌株[5]。

表4 HSX-21 分离株与参考毒株的核苷酸序列同源性Table 4 Nucleotide sequence identity of the rotavirus HSX-21 strain compared with the reference rotavirus strains

在体外分离轮状病毒过程中，胰酶的添加浓度直接关系到分离成功与否，本研究在分离内蒙古毒株时使用30 µg/mL胰酶浓度预处理接种物，维持液中添加5 µg/mL的胰酶，盲传4代后细胞出现病变，表现为细胞肿大，拉网空泡等现象，表明已经从腹泻粪样中分离到牛轮状病毒。VP7构成病毒的外衣壳，是病毒的主要中和抗原，决定病毒的G血清型，是诱导机体产生中和抗体的最主要抗原，VP4可介导病毒和易感细胞的早期吸附，使病毒具有吸附性，还能使某些动物和人的红细胞发生凝集，在胰酶作用下增加空斑形成，说明与病毒毒力有密切关系，自然感染时能够刺激机体产生中和抗体[16]，根据VP7和VP4抗原的不同可将同群的轮状病毒分为不同的G型和P型，根据轮状病毒最新分类标准，VP7和VP4核苷酸同源性高于80%即为同一基因型[17]，以VP7和VP4基因引物对分离毒株进行鉴定分型，并与NCBI参考毒株进行同源性比对，发现牛源BRV的毒株同源性均达80%以上，对比结果表明本试验分离得到BRV为G6P[1]型，这一结果也进一步证实我国流行的牛轮状病毒血清型，通过遗传进化分析VP7和VP4与中国分离毒株亲缘关系相近，对今后疫苗研发具有重要意义，也为有效防控内蒙古自治区的牛轮状病毒感染提供理论基础和实验依据。对于该毒株其他主要结构基因的序列分析以及在内蒙古自治区牛群中的感染情况和发病情况是本试验亟待研究的内容。