布鲁菌Irr蛋白的生物信息学分析、表达纯化以及ELISA方法的初步建立

孙天浩，张 倩，曹旭东，李 楠，程科建，张江伟，王 震,，陈创夫,

（1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新中心，石河子 832000；3.新疆农垦科学院，石河子 832000）

布鲁菌病（Brucellosis），是由胞内生存的布鲁菌引起的一种严重危害人和家畜健康的人兽共患传染病，其可以引起人的波浪热，母畜流产以及公畜睾丸炎等症状，严重阻碍畜牧业的发展和公共卫生安全[1]。铁不仅是宿主生长繁殖不可或缺的基本元素，也是绝大多数微生物必备的营养元素，影响并调控多种胞内菌的生存和复制[2]。Irr是布鲁菌铁代谢的重要转录调控因子，前期研究显示，在细胞中铁浓度很低时，游离的Irr蛋白可以结合到一些与铁利用相关靶基因上游的ICE BOX抑制它们的表达；在细胞中铁浓度过高时，Irr蛋白则与血红素结合丧失DNA结合能力，使铁利用相关基因得以表达[3]。Irr蛋白是如何精确调控铁代谢并影响细菌毒力的这种机制尚不清楚。因此，本研究通过对布鲁菌Irr蛋白进行生物信息学分析，对其抗原表位等进行预测，为其作为候选诊断蛋白提供理论支持，构建布鲁菌Irr蛋白原核表达载体，检测其免疫原性，以Irr蛋白作为诊断蛋白初步建立间接ELISA方法，使我们更深入的了解Irr蛋白，同时为Irr蛋白作为诊断靶标奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料E.coliBL21（DE3）表达菌购自北京全式金生物技术有限公司；pCzn1质粒、TOP10菌株购自南京钟鼎生物技术有限公司。

1.2 主要试剂2×TaqMaster Mix、限制性内切酶NdeⅠ和XbaⅠ、DNA Ligation Kit、DNA marker均购自北京康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；IgG-HRP抗体购自北京索莱宝科技有限公司公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 Irr蛋白生物信息学分析根据GenBank上公布的流产布鲁菌2308菌株irr基因（登录号：AY243456）的信息，下载基因序列及氨基酸序列，通过TMHMM Server v.2.0软件在线分析Irr蛋白的氨基酸序列，预测其蛋白跨膜区；应用SignalP4.1 Server在线分析Irr蛋白的氨基酸序列，预测其信号肽；通过ProtScale软件对Irr蛋白进行亲疏水性分析；通过SOPMA在线软件预测Irr蛋白的二级结构；使用SWISS-MODEL软件对Irr蛋白三级结构分析，建立了Irr蛋白的3D模型；利用在线软件 ProtParam对Irr蛋白进行理化性质分析；通过NCBI预测Irr蛋白的保守结构域；使用IEDB在线软件预测分析Irr蛋白线性B细胞抗原表位和抗原表位序列以及CD4 T细胞免疫原性；应用ProAcePred在线软件对Irr蛋白进行乙酰化位点预测；利用NetPhos 3.1 Server对Irr蛋白进行磷酸化位点预测；通过NetNGIyc 1.0 Server在线软件对Irr蛋白进行糖基化修饰位点预测；应用iDNA4mC对Irr蛋白甲基化修饰位点进行预测，应用Cell-PLoc 2.0对Irr蛋白的亚细胞定位进行预测。

1.4 目的基因合成及验证将irr基因序列送南京钟鼎生物技术有限公司合成，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，使用公司合成irr基因序列为模板，通过PCR扩增irr基因，验证基因大小是否正确。上游引物：5'-CCATATGATGCATTCTTCACA TACCCA-3'；下游引物：5'-CTCTAGATCAG CGGGCCTGACGGCG-3'。所用的限制性内切酶分别为NdeⅠ和XbaⅠ，酶切位点序列分别添加下划线表示。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 表达载体和表达菌株的构建取验证正确的PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析并回收目的片段，将纯化的PCR产物连接pCzn1载体，转入Top10克隆菌株中，筛选阳性菌落。选取阳性菌落接入含氨苄抗性的液体LB培养基中，过夜培养。用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒，酶切验证，选取正确的阳性菌液保菌，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将构建的pCzn1-irr重组质粒转入E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，涂布于含氨苄抗性的固体LB培养基中，筛选阳性菌落并进行酶切验证。

1.6 目的蛋白的表达及纯化选取正确的阳性菌转接至含氨苄抗性的液体LB中培养至OD600约为0.5，取出1 mL菌液作为对照，加入IPTG诱导剂，分别取诱导2、4、6、8 h各 1 mL菌液，进行SDS-PAGE蛋白检测。将表达正确的蛋白采用镍柱纯化法纯化，获取目的蛋白。

1.7 Western blot分析检测将 SDS-PAGE凝胶上的蛋白样品用湿式转膜仪转印到PVDF膜上，以羊布鲁菌病阳性血清作为一抗，兔抗羊IgG-HRP为二抗，ECL显色液显色。

1.8 间接ELISA方法的初步建立

1.8.1 最适反应条件的确定 采用棋盘式方法测定重组蛋白Irr最佳包被量，一抗、二抗的最佳稀释浓度、封闭液的选择以及一抗、二抗的孵育时间，确定重组蛋白Irr作为诊断抗原的最佳条件。

1.8.2 临界值的确定 取30份布鲁菌病的阴性血清样品，依据最佳反应条件进行间接 ELISA 检测，根据OD450值计算平均值¯x和标准偏差SD，根据阴阳判定临界值¯x+3SD确定该ELISA方法的阴阳性临界值。

1.8.3 特异性试验 利用已建立的间接ELISA方法，检测布鲁菌病阳性血清和绵羊肺腺瘤病、羊梅迪-维斯纳病、羊巴氏杆菌病的阳性血清样品，评价该方法的特异性。

1.8.4 敏感性试验 将布鲁菌病阳性血清按照1∶50开始依次梯度稀释，依据最佳反应条件进行间接ELISA检测，以确定该ELISA方法的敏感性。

1.8.5 稳定性试验 取7份已知布鲁菌病抗体阳性羊血清，1份阴性血清采用同一时间段包被抗原的3块ELISA板（批间）和不同时间段包被抗原的3块ELISA板（批次）同时进行试验，测量OD450值，通过计算布鲁菌病血清批内批间重复试验的变异系数判断重复性。

1.8.6 临床样本的检测 采用以上建立的间接ELISA方法对60份羊血清进行临床样品检测，同时通过凝集实验进行临床样本的检测，测定二者的符合率。

2 结果

2.1 目的蛋白的生物信息学分析通过TMHMM Server v.2.0软件在线分析预测Irr蛋白跨膜区，该蛋白无跨膜螺旋结构（图1A）。应用SignalP4.1 Server在线分析预测其信号肽，该蛋白无信号肽（图1B）。通过ProtScale软件对Irr蛋白进行亲疏水性分析，该蛋白为亲水性蛋白（图1C），平均亲水指数为-0.310，第32位丝氨酸疏水性最强（最高分值为2.633），第114位组氨酸，亲水性最强（最低分值为-2.011）。通过SOPMA在线软件预测Irr蛋白的二级结构，该蛋白有145个氨基酸参与形成α-螺旋，占32.41%，延伸链占17.24%，有9个氨基酸参与形成β-折叠，占6.21%，无规卷曲结构占44.14%（图1D）。

图1 Irr蛋白跨膜区（A）、信号肽（B）、亲疏水性（C）及二级结构（D）Fig.1 Irr protein transmembrane region (A),protein signal peptide (B),hydrophilicity and hydrophobicity (C),and secondary structure (D)

利用在线软件ProtParam对Irr蛋白进行理化性质分析，结果表明，Irr蛋白由145个氨基酸组成，包含18种氨基酸（图2A），分子式为C709H1118N210O220S6，相对分子质量为16 296.31。Irr蛋白含有负电荷氨基酸残基数为21个，正电荷氨基酸残基数为12个，该蛋白的理论等电点为5.48。Irr蛋白在体外哺乳动物网织红细胞中半衰期为30 h，酵母菌体内>20 h，大肠杆菌中>10 h，不稳定指数为43.16（高于阈值40），表明Irr蛋白为不稳定蛋白。使用SWISS-MODEL软件对Irr蛋白三级结构分析，建立了Irr蛋白质的3D模型，结果表明通过同源建模得到的Irr蛋白的3D模型比较合理，其空间结构较为稳定（图2B）。通过NCBI预测Irr蛋白的保守结构域，该蛋白属于Fur家族（图2C），是细菌中铁吸收调节家族的转录因子成员，对转录过程发挥阻遏作用。

图2 Irr蛋白理化性质分析(A)、三级结构预测(B)以及保守结构域预测(C)Fig.2 Analysis of physical and chemical properties of Irr protein (A),tertiary structure prediction (B),and prediction of conserved domains (C)

使用IEDB在线软件预测分析蛋白线性B细胞抗原表位及CD4 T细胞免疫原性。Irr蛋白有6个B细胞抗原表位、3个T细胞抗原表位。应用ProAcePred在线软件对Irr蛋白进行乙酰化位点预测，该蛋白无乙酰化修饰位点。利用NetPhos 3.1 Server对Irr蛋白进行磷酸化位点预测，该蛋白含有7个苏氨酸磷酸化修饰位点、8个丝氨酸磷酸化修饰位点和0个酪氨酸磷酸化修饰位点，包含6类蛋白质激酶结合位点（cdc2、PKA/PKC、CKI、RSK、unsp)（图3A）。通过NetNGIyc 1.0 Serve在线软件对蛋白进行糖基化修饰位点预测，Irr蛋白在Asp65、Asp91、Asp104、Asp121、Asp133这5个位点发生N-糖基化修饰（图3B）。应用iDNA4mC对Irr蛋白甲基化修饰位点进行预测，其有45个位点可能发生甲基化修饰。应用Cell-PLoc 2.0对Irr蛋白的亚细胞定位预测显示其定位于胞质。

图3 Irr蛋白磷酸化位点预测（A）和糖基化修饰位点预测（B）Fig.3 Prediction of Irr protein phosphorylation sites (A) and prediction of glycosylation modification sites (B)

2.2 目的基因及重组质粒的酶切验证将PCR产物用1.5%琼脂糖电泳进行检测，在490 bp有明显的条带并与irr基因序列大小相符（图4A）。pCzn1-irr重组质粒经限制性内切酶酶切后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，与预期结果相符(图4B)，表明irr基因成功插入表达载体中。

图4 irr基因PCR扩增结果（A）和表达载体酶切鉴定（B）Fig.4 PCR amplification results of irr gene (A) and dentification of expression vector by enzyme digestion (B)

2.3 重组蛋白的表达纯化与鉴定IPTG诱导含有重组质粒的E.coliBL21（DE3）菌液，诱导后可见约16.3 kDa的特异性条带，其分子质量与重组质粒表达蛋白的分子质量相当。经SDS-PAGE凝胶电泳分析得出6 h时，重组蛋白Irr的表达量最大（图5A）。将表达正确的蛋白采用镍柱纯化法纯化，获取纯化后的重组蛋白Irr（图5B）。

图5 重组蛋白Irr诱导表达（A）、重组蛋白Irr纯化（B）及重组蛋白Irr Western blot 鉴定（C）Fig.5 The recombinant protein Irr was induced to express (A),Purification of Irr recombinant protein (B),and Western blot analysis of expressed products (C)

采用羊布鲁菌病阳性血清和阴性血清作为一抗，HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗，进行Western blot分析，结果可见，采用羊布鲁菌病阳性血清作为一抗孵育，在重组蛋白Irr的位置上出现明显的条带，而作为阴性对照的E.coliBL21（DE3）没有出现条带；采用羊布鲁菌病阴性血清作为一抗孵育的E.coliBL21（DE3）与重组蛋白Irr均未出现明显条带（图5C）。

2.4 Irr蛋白间接ELISA方法的建立

2.4.1 间接ELISA方法最适反应条件的确定 采用棋盘式方法测定Irr蛋白最佳包被量、一抗、二抗的最佳稀释浓度、封闭液的选择以及一抗、二抗、血清的孵育时间。确定Irr蛋白作为诊断抗原的最佳优化条件为：重组蛋白Irr的包被量为浓度为0.25 μg，选择5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗为1∶500（孵育2 h），二抗为1∶5000（孵育2 h），显色15 min。此时P/N为3.09。

2.4.2 ELISA方法临界值的确定 通过对30份羊布鲁菌病阴性血清进行ELISA检测，使用统计学软件SPSS计算得出阴性血清样品平均值（）=0.35和标准差（SD）=0.10。因此，当检测样品OD450≤0.55就可以判定血清样品抗体为阴性；OD450≥0.65就可以判定血清样品抗体为阳性；当检测样品0.55

表1 重组蛋白Irr、待检血清及二抗稀释度浓度结果Table 1 pCzn1-irr protein,test serum and secondary antibody dilution concentration results

表2 封闭液的选择及封闭时间的结果Table 2 Selection of sealing fluid and results of sealing time

表3 血清孵育时间的结果Table 3 Results of serum incubation time

表4 二抗孵育时间的结果Table 4 Results of secondary antibody incubation time

表5 显色时间的结果Table 5 Results of color development time

2.4.3 ELISA方法特异性实验结果 使用建立的ELISA方法检测羊布鲁菌病，绵羊肺腺瘤病，羊梅迪-维斯纳病，羊巴氏杆菌病的阳性血清，结果显示，所检血清样品中，仅有已知布鲁菌病阳性血清显示为阳性，其余血清抗体均为阴性（表6），表明基于重组蛋白Irr所建 ELISA 方法有良好的特异性。

表6 重组蛋白Irr间接ELISA特异性的结果Table 6 Indirect ELISA specific results of Irr protein

2.4.4 ELISA方法敏感性结果 以Irr蛋白为抗原建立的方法能检测到阳性血清稀释比为1∶800时，OD450为0.63，经过复检，OD450为0.62，其数值仍在可疑区间，即判定为阳性，而阳性血清稀释比为1∶1600时，OD450为0.51，即判定为阴性，因此以Irr蛋白为抗原建立的方法能检测到阳性血清稀释比为1∶800。

2.4.5 ELISA方法稳定性结果 将7份羊布鲁菌病阳性血清和1份布鲁菌病阴性血清分别进行批内和批间重复性试验，经SPSS软件分析，结果显示批内重复变异系数（CV）均低于5%，平均变异系数为 1.92%（表7），批间重复变异系数均低于10%，平均变异系数为3.38%（表8）。表明基于Irr蛋白为抗原建立的ELISA方法有较好的重复性。

表7 重组蛋白Irr间接ELISA批间稳定性结果Table 7 Interbatch stability of Irr protein by indirect ELISA

表8 重组蛋白Irr间接ELISA批次稳定性结果Table 8 Indirect ELISA batch stability of Irr protein

2.4.6 ELISA方法临床样品的检测 采用以上建立的间接ELISA方法对60份血清进行临床样品检测，检出阳性血清18份，阴性血清42份，用布鲁菌病凝集实验检测60份相同的血清样本，结果显示阳性血清20份，阴性血清40份，共同检出阳性血清18份，阴性血清40份，两者的符合率为（40+18）/60=96.7%（表9）。

表9 重组蛋白Irr间接ELISA临床样本结果Table 9 Irr protein indirect ELISA results of clinical samples

3 讨论

铁是多细胞生命体和几乎所有微生物必须的重要微量元素，不仅参与氧气运输、电子转移和能源代谢等基本代谢途径，而且在基因表达调控、细胞增殖分化、凋亡、免疫防御过程中发挥着作用[4]。铁调控因子Irr被报道在根瘤菌（与布鲁菌同属α-变形菌）的铁代谢调控中发挥着关键作用[5]。已有研究表明Irr是α-变形杆菌主要的铁调控因子，在布鲁菌中Irr在亚铁血红素转运蛋白BhuA的表达过程中起着重要作用[6]。除了irr基因，也有一些基因参与了铁的调控，如rirA[7]、Fur[8]、RyhB[9]、DtxR[10]、Mur[11]等，这一系列的铁调控因子，使布鲁菌获取可以满足其正常的生理水平的铁离子。然而与铁代谢相关的基因有很多，仍需要我们进一步去发现并研究其具体的分子机制。

通过对Irr蛋白的生物信息学分析，研究发现可能不参与胞内外信号的转导，而且该蛋白没有信号肽，为亲水性蛋白，其亚细胞定位结果表明，该蛋白定位于胞质中，这意味着该蛋白可能属于非分泌蛋白，不能分泌到布鲁菌体外发挥作用。对Irr蛋白结构、功能的可视化分析，研究发现蛋白属于Fur家族，是细菌中铁吸收调节家族的转录因子成员，对转录过程发挥阻遏作用[12]。Wu等[13]最新研究发现，磷酸化修饰对蛋白质的表达稳定性产生影响，周小菊等[14]也指出，糖基化修饰的质与量的差异影响了蛋白的表达水平、结构及功能，如蛋白的更新及降解，因此，对蛋白修饰化的预测将有助于基因的改造和蛋白表达条件的优化甚至酶处理等。本研究通过对Irr蛋白的修饰化进行分析，其无乙酰化修饰位点，5个糖基化位点，有7个苏氨酸磷酸化修饰位点、8个丝氨酸磷酸化修饰位点以及45个甲基化修饰位点，这为今后对Irr重组蛋白减缓蛋白降解，增加表达量，增强免疫原性等的深入研究奠定了基础。同时irr基因作为转录因子，修饰前后转录因子的转录活性及转录因子对下游基因转录区域的结合水平是否发生变化需要进一步深入研究探讨。

通过对Irr蛋白的B细胞、T细胞抗原表位预测和Western blot分析结果也证明了该蛋白具有良好的反应原性，可作为布鲁菌病血清学诊断的潜在靶标。同时本试验以重组蛋白Irr为诊断抗原所建立的间接ELISA法具有灵敏度高，特异性高，重复性好的特点，可以作为布鲁菌病血清学诊断的辅助手段。

综上所述，本试验通过对Irr蛋白氨基酸进行生物信息学分析预测，成功构建了irr基因的原核表达载体并表达纯化获得了Irr蛋白，并通过Western blot分析验证其所表达的蛋白具有良好的反应原性，同时以Irr蛋白作为诊断抗原初步建立了间接ELISA的方法。为Irr蛋白作为诊断靶标提供了理论支持，也为布鲁菌病的诊断和流行病学调查提供了必要手段。