基于IL-13/STAT6信号通路研究祛风宣痹方对哮喘气道黏液高分泌的影响*

喻柯瑶，史潇璐，王博寒，张晓娜，汤玲玲，孙宪泓，刘 丽，徐艳秋

1南京中医药大学附属医院，南京 210029；2南京市江宁中医院，南京 210000

气道黏液高分泌导致的气道阻塞是哮喘发病过程中的关键环节，也是导致哮喘患者发病和死亡的重要因素[1]。因此，靶向治疗气道黏液高分泌成为减少哮喘发作频率和延缓其进展的重要途径。气道黏液是由水、糖类、脂质、黏蛋白等所组成的混合物，其中黏蛋白是气道黏液最主要的成分，黏性蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）是气道黏液中最主要的黏蛋白[2，3]。有研究表明[4]，MUC5AC 黏蛋白基因与哮喘的关系最为密切，在气道炎症刺激的情况下，MUC5AC基因表达上调，哮喘患者气道黏蛋白MUC5AC 分泌过度，痰液阻塞气道，引起患者气道通气功能障碍、纤毛清除功能下降、炎症加重、气道重塑等，是推进气道炎症持续进展、哮喘反复发作和迁延不愈的重要病理阶段。相关研究表明[5]，白细胞介素-13（interleukin 13，IL-13）通过激活信号转导和转录激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）形成的IL-13-STAT6-MUC5AC 黏液分泌通路，与哮喘气道黏液高分泌状态密切相关。

祛风宣痹方（平哮合剂）是江苏省中医院院内制剂，临床实践证明其能够有效治疗和控制哮喘的发作[6]。前期研究表明[7]，祛风宣痹方能够改善哮喘小鼠病理反应，减少哮喘小鼠的肺组织嗜酸性粒细胞、炎症细胞浸润，下调炎症因子IL-4、IL-13、IL-17 及IgE 水平，调节T 细胞平衡等。本实验通过建立以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的哮喘小鼠模型和IL-13 诱导的A549 细胞黏液分泌病理模型来探讨祛风宣痹方对气道黏液分泌及IL-13/STAT6信号通路的影响。

1 实验材料

1.1 动物与细胞

清洁级雌性Balb/c 小鼠24 只，6～8 周龄，体质量18～22 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK（上海）2017-0005，实验动物使用许可证号为SYXK（苏）2017-0069，饲养于南京中医药大学附属医院SPF 级动物实验室，室温20～24℃，相对湿度45%～50%。A549 细胞购于中国科学院细胞资源中心。

1.2 伦理审查

本研究经南京中医药大学附属医院动物实验伦理委员会审批通过，批件编号为2021 DW-07-02。

1.3 试验药物

祛风宣痹方（QFXBF）：射干10 g，炙麻黄6 g，制僵蚕10 g，瓜蒌10 g，薤白10 g，海风藤20 g，白芍15 g，炙甘草5 g，葶苈子10 g，蛤壳20 g，桃仁10 g，苦杏仁10 g，地龙10 g，黄芩10 g，蛇床子10 g。饮片购于江苏省中医院。所有饮片分次煎制、浓缩至原药材浓度为1.66 g·mL-1煎剂，4℃保存备用。祛风宣痹方冻干粉由上海中医药大学中药现代制剂中心制作，每克冻干粉相当于原药材5.32 g，使用时以RPMI 1640 细胞培养基稀释至相应浓度用于细胞实验。

1.4 主要试剂与仪器

卵清蛋白（美国Sigma 公司）；氢氧化铝凝胶（中国医药集团有限公司）；IL-13（派普泰克生物科技有限公司）；RMI 1640 培养基、胎牛血清（德国BI 公司）；青霉素-链霉素溶液（美国ThermoFisher Scientific 公司）；IL-13 ELISA 检测试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）；STAT6 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；p-STAT6 抗体、β-actin 抗体（美国Affinity Biosciences 公司）；MUC5AC 抗体（美国Abcam 公司）；兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；MTT（上海碧云天生物技术有限公司）；荧光二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。

HERA cell 1501 CO2细胞培养箱（美国ThermoFisher Scientific 公司）；ELX -800 酶标仪、041BR142554 蛋白电泳仪、L520 CHEMIDOC XRS+凝胶成像系统（美国Bio-Bad 公司）；Heraeus Fresco21 离心机（德国Eppendorf 公司）；CKX41 倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）；ECLIPSE Ts2R-FL 荧光倒置显微镜（日本Nikon 公司）。

2 实验方法

2.1 动物造模、分组及给药

24 只小鼠随机分为对照组、哮喘组和祛风宣痹方组，每组8 只。在第0 天和第14 天，哮喘组、祛风宣痹方组的小鼠通过腹腔内注射200 μL 浓度为0.5 mg·mL-1的OVA 和氢氧化铝混合液致敏。在第14、25、26 和27 天，小鼠鼻内给药OVA 溶液50 μL（2 mg·mL-1），对照组使用同等体积生理盐水。小鼠在滴鼻前呼吸平稳，滴鼻过程中出现挠鼻、咳嗽、烦躁、呼吸加快等表现，激发后2 min 内咳嗽次数增多表明造模成功。第14 天至第27 天之间，祛风宣痹方组小鼠每天灌胃给予祛风宣痹方一次（25 g·kg-1）[7]，对照组和哮喘组小鼠接受生理盐水0.2 mL。

2.2 细胞培养、分组及药物干预

A549 细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640、100 mg·L-1链霉素和100 mg·L-1青霉素的培养基养在培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合达70%～80%时用胰蛋白酶消化进行实验。

将A549 细胞以5000 个/孔接种于96 孔板，予不同浓度祛风宣痹方（37.5、75、150、300、600 μg·mL-1）干预24 h 后，加入MTT（5 mg·mL-1）溶液10 μL，培养箱孵育4 h，弃去MTT 液，每孔加入DMSO 150 μL，避光低速振荡10 min，酶标仪测定每孔在490 nm 处的吸光值（A），按公式（A实验组-A对照组）/A对照组×100%计算细胞活力，筛选祛风宣痹方最佳作用浓度。

将A549 细胞以5000 个/孔接种于96 孔板，分为对照组（完全培养基）、IL-13 组（IL-13 终浓度50 ng·mL-1）、IL-13+祛风宣痹方组（IL-13 终浓度50 ng·mL-1，祛风宣痹方终浓度300 μg·mL-1）和祛风宣痹方组（祛风宣痹方终浓度300 μg·mL-1），分别处理24 h。

2.3 标本采集

实验结束后，称量小鼠体质量，麻醉后摘眼球取血，用于检测血清中IL-13 水平。剪开胸腔，分离气管，将肺组织置于4%中性甲醛溶液固定后进行HE、PAS 染色和MUC5AC、p-STAT6 免疫组化实验。

2.4 指标检测

2.4.1 肺组织病理学观察 肺组织经固定、脱水、透明、石蜡包埋后切片。

HE 染色：切片常规脱蜡、水化后苏木素染核，1%盐酸酒精显蓝，酒精脱水，伊红染细胞质，酒精脱水、二甲苯透明，自然风干，中性树胶封片，光学显微镜下观察肺组织病理改变。

糖原PAS 染色：上述切片常规脱蜡至水，阿利新蓝染色液染色，蒸馏水水洗，过碘酸溶液氧化，Schiff 试剂浸染，苏木素染细胞核，酸性分化液分化，滴入Scott 蓝化液反蓝，水洗后酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片、固定，光学显微镜下观察气道黏液分泌情况。

2.4.2 肺组织MUC5AC、p-STAT6 免疫组化染色石蜡包埋块，切片，脱蜡至水，磷酸盐缓冲液冲洗，H2O2灭活内源性酶，蒸馏水、PBS 清洗，山羊血清封闭，加一抗，4℃孵育过夜。清洗后孵育二抗，DAB 显色，苏木精复染细胞核，脱水，透明，中性树脂封片，应用Image J 软件计算MUC5AC、p-STAT6 染色阳性结果平均光密度值。

2.4.3 ELISA 检测 收集小鼠外周血，于4℃以4000 r·min-1离心10 min 取血清。参照IL-13 检测试剂盒说明书步骤进行检测，酶标仪波长450 nm 测量吸光度A，根据标准曲线回归方程计算小鼠血清中IL-13 含量。

2.4.4 免疫荧光检测 96 孔板培养24 h 的A549细胞，4%免疫荧光固定液30 min，10%的山羊血清封闭1 h，加入抗MUC5AC 抗体（1∶100）、抗p-STAT6 抗体（1∶100）4℃过夜。0.3%Triton 洗涤，二抗孵育1 h，DAPI 染色5 min，加入30 μL 抗荧光淬灭剂后荧光显微镜下拍照。用Image J 软件分割通道得到8 bit 的黑白图像，在一定的阈值下，分析其荧光强度（以灰度值代替）和面积。平均荧光强度即平均灰度值=积分灰度值/面积。

2.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行统计分析，GraphPad 9.0 软件进行科研绘图。免疫组化及免疫荧光计量数据以Image J 计算并导出。所有数据以（）表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠肺组织病理改变

各组小鼠肺组织病理改变结果（图1）显示，对照组小鼠肺组织、气道黏膜上皮及肺泡结构相对完整。与对照组比较，哮喘组小鼠支气管黏膜部分损失，气道管壁周围可见较多炎症细胞浸润；与哮喘组比较，祛风宣痹方组小鼠支气管管壁形态趋于正常，支气管周围炎症细胞浸润减少。

图1 对照组（A）、哮喘组（B）及祛风宣痹方组（C）小鼠肺脏组织HE 染色图（×200）

3.2 各组小鼠气道黏液物质的变化

PAS 染色可使多糖类及糖蛋白如黏蛋白MUC5AC 呈紫红色[8]，黏蛋白MUC5AC 阳性呈紫红色区。本实验中，对照组小鼠气道组织中几未见紫红色区域；哮喘组小鼠较多处区域呈现出紫红色，说明气道黏液分泌增多；祛风宣痹方组气道黏液物质分泌可见明显减少（图2）。

图2 对照组（A）、哮喘组（B）及祛风宣痹方组（C）小鼠肺脏组织PAS 染色图（×200）

3.3 各组小鼠肺组织中MUC5AC、p-STAT6 表达情况

镜下观察MUC5AC、p-STAT6 蛋白表达阳性细胞可呈黄色或棕黄色。结果显示，正常组小鼠肺组织中几未见MUC5AC 蛋白表达；哮喘组小鼠肺组织中可见MUC5AC 较高表达（P ＜0.05），祛风宣痹方组小鼠肺组织中棕黄色阳性表达较哮喘组明显减少（P ＜0.05）。与对照组相比，哮喘组小鼠肺组织中p-STAT6 蛋白阳性颗粒明显增多（P ＜0.01）；与哮喘组相比，祛风宣痹方组p-STAT6 蛋白阳性颗粒则明显减少（P ＜0.01）。见图3、表1。

表1 各组小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白免疫组化平均光密度值表达结果（，n=3）

表1 各组小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白免疫组化平均光密度值表达结果（，n=3）

注：与OVA组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

图3 对照组（A）、哮喘组（B）及祛风宣痹方组（C）小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白表达（×200）

3.4 各组小鼠血清中IL-13 的表达情况

与对照组相比，哮喘组小鼠血清中IL-13 含量明显增高（P ＜0.01）；与哮喘组相比，祛风宣痹方组IL-13 含量显著减少（P ＜0.01）。见表2。

表2 各组小鼠血清中IL-13 含量（ng·L-1，，n=4）

表2 各组小鼠血清中IL-13 含量（ng·L-1，，n=4）

注：与OVA组比较，**P ＜0.01。

3.5 不同浓度祛风宣痹方对A549 细胞活力的影响

结果显示，与正常对照组比较，37.5、75、150、300 μg·mL-1[6]祛风宣痹方对细胞活力无显著影响（P ＞0.05），而600 μg·mL-1祛风宣痹方则能降低A549细胞活力（P ＜0.05），提示过高浓度祛风宣痹方可能具有一定程度细胞毒性，因此选择300 μg·mL-1进行后续实验。见表3。

表3 不同浓度祛风宣痹方对A549 细胞活力的影响（，n=6）

表3 不同浓度祛风宣痹方对A549 细胞活力的影响（，n=6）

注：与对照组比较，**P ＜0.01。

表4 各组细胞中MUC5AC、p-STAT6 蛋白平均荧光强度变化（，n=3）

表4 各组细胞中MUC5AC、p-STAT6 蛋白平均荧光强度变化（，n=3）

注：与IL-13组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

3.6 A549 细胞中MUC5AC、p-STAT6 表达情况

在免疫荧光染色中，A549 细胞胞浆中MUC5AC蛋白阳性呈绿色荧光。对照组细胞内MUC5AC 有少量阳性表达；IL-13 组MUC5AC 表达量明显增多，且多于正常组及IL-13+祛风宣痹方组（P ＜0.05）。

A549 细胞核内p-STAT6 蛋白表达呈绿色荧光。与对照组比较，IL-13 组绿色荧光强度显著增强（P ＜0.01）；与IL-13 组比较，IL-13+祛风宣痹方组细胞核内绿色荧光强度则有较为明显的降低（P ＜0.05）。见图4。

图4 对照组（A）、IL-13 组（B）、IL-13+祛风宣痹方组（C）及祛风宣痹方组（D）A549 细胞MUC5AC、p-STAT6 蛋白表达（×200）

4 讨论

传统医学认为，哮喘属于“哮证、喘证”的范畴，其基本病机为“痰伏于内”。气道黏液高分泌状态与中医学的“伏痰”关系密切，二者有着共同的物质基础“痰”。祛风宣痹方具有祛风宣痹、化痰通阳、肃肺平喘之功效，临床疗效表明，祛风宣痹方可有效缓解患者咳嗽痰鸣、胸闷等“伏痰于内”相关临床表现[9]。因此，祛风宣痹方可能通过改善气道黏液高分泌减轻哮喘发作。在本研究中，相较于哮喘组小鼠，祛风宣痹方组小鼠气道黏液分泌明显减轻，MUC5AC 蛋白表达也明显降低；同时，祛风宣痹方能减轻A549 细胞MUC5AC 蛋白表达，证明祛风宣痹方可以通过抑制MUC5AC 的表达从而减少哮喘气道黏液分泌。

IL-13 是一种主要由活化的Th2 细胞分泌免疫的调节细胞因子，被认为是哮喘发病过程中的关键介质[10]。相关文献指出[11，12]，IL-13 在诱导哮喘包括气道高反应性、黏液分泌增加等的病理特征中起重要作用。KIM S 等[13]的实验表明，IL-13 可增加A549细胞中STAT6 的磷酸化以及MUC5AC mRNA 和蛋白的表达从而促进黏液分泌。

STAT6 是STAT 蛋白家族成员之一，STAT 蛋白可以被激活后的Janus 激酶（JAKS）磷酸化形成二聚体进入细胞核内，诱导相应基因的转录和表达[14]。JAK/STAT 途径与哮喘的发生密切相关，而IL-13是STAT6 信号通路激活的重要信号因子[15]。IL-13可通过与IL-13Ra 亚基结合，形成IL-13Ra/IL4Ra受体复合物，激活JAK/STAT6 信号通路后引起STAT6 的磷酸化[16-18]。p-STAT6 进入细胞核诱导MUC5AC 基因转录与蛋白表达，导致哮喘的气道黏液分泌增加。本实验发现，祛风宣痹方能降低哮喘小鼠外周血中IL-13 水平及其肺组织中的p-STAT6 蛋白量，这与细胞实验中p-STAT6 表达趋势相一致。这表明祛风宣痹方可能是通过抑制IL-13/STAT6 通路的激活来减轻哮喘黏液过度分泌，从而缓解哮喘发作。

综上所述，祛风宣痹方能通过抑制哮喘黏液高分泌，从而治疗哮喘。其机制可能与抑制IL-13/STAT6 通路的表达相关，进一步的机制探索还需课题组展开后续实验，以期为临床提供更多实验依据。