超快速液相色谱法同时测定刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E的含量

关皎，丁思宇，王宜优，葛胜宇，王军民，朱鹤云，韩丽琴（.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 303；.吉林医药学院附属医院，吉林 吉林 30）

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.Et Maxim.）Harms 的干燥根和根茎或茎，广泛分布于中国东北部、日本、韩国和俄罗斯东部地区，具有益气健脾、补肾安神的功效[1]。药理学研究[2-6]表明，刺五加对心脑血管系统和中枢神经系统具有保护作用，同时还具有抗疲劳、抗应激、增强免疫力、抗辐射及抗肿瘤等作用。采用刺五加作为主要组分制备而成的刺五加注射液临床上广泛应用于冠心病心绞痛、脑梗死、高血压等疾病的治疗，具有广阔的应用前景[7-9]。

刺五加的化学成分主要包括苷类、黄酮类、木脂素类、香豆素类等[10-11]。其中，苷类成分是刺五加中的主要活性成分，包括刺五加苷B（又名紫丁香苷）和刺五加苷E等。刺五加苷具有较好的抗氧化和亚硝酸盐去除活性[12]；刺五加苷B具有改善高原肺水肿、抗运动性疲劳、改善疲劳小鼠学习记忆能力、抗肿瘤等作用[13-16]；刺五加苷E 具有抗帕金森、抗肺动脉高压、防治心肌梗死等作用[17-19]。2020年版《中国药典》仅以刺五加苷B作为定量指标来控制刺五加药材的质量，无法全面控制刺五加药材的质量。目前刺五加苷B和刺五加苷E的含量测定方法主要有高效液相色谱法[20-23]，但存在样品预处理复杂、专属性差、出峰时间长等缺点。超快速液相色谱（Ultra fast liquid chromatography，UFLC）技术可以缩短分析时间，改善分离度和灵敏度，降低溶剂消耗，已被广泛应用[24-25]。本研究首次建立UFLC 法同时测定刺五加中苷类成分刺五加苷B和刺五加苷E的含量，具有分析时间短、分离效果好的优点，可为刺五加药材的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Prominence UFLC超高快速液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-250DE数控声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TG16KR离心机（天津东旺仪器有限公司）；CPA 225D 百万分之一电子天平（德国赛多利斯仪器有限公司）；FW80高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药甲醇，色谱纯，美国Fisher 科技有限公司；刺五加苷B 对照品（批号：MUST-22011212；纯度：99.1%）、刺五加苷E 对照品（批号：MUST-22072402，纯度：99.5%），成都曼思特生物技术有限公司，结构式见图1；刺五加药材（购于吉林大药房，批号：2023001-2023006；产地：辽宁）经吉林医药学院中药学教研室李景华教授鉴定为五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus（Rupr.et Maxim.）Harms 的干燥根和根茎或茎。

图1 刺五加苷B（A）和刺五加苷E（B）的结构式Figure 1Structural formula of eleutheroside B（A）and eleutheroside E（B）

2 方法与结果

2.1 色谱条件采用Shim-Pack XR-ODS 柱（75 mm×3.0 mm，2.2 μm）；H2O（A）-CH3OH（B）为流动相，梯度洗脱（0～1 min，10% B→35% B；1～5 min，35% B→50% B；5～8 min，50%B→60%B）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30 °C；进样量：5 μL；平衡时间：5 min；检测波长：215 nm。典型色谱图见图2。

图2 混合对照品（A）和刺五加样品（B）的超快速液相色谱图Figure 2 UFLC chromatograms of mixed reference substances（A）and sample of Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis（B）

2.2 对照品溶液的配制分别精密称取刺五加苷B和刺五加苷E 对照品5 mg，置于5 mL 容量瓶中，水-甲醇（50∶50，V/V）溶解并定容，即得浓度均为1 mg·mL-1的刺五加苷B和刺五加苷E对照品储备液。

2.3 供试品溶液的配制刺五加药材粉碎，过40 目筛后精密称取2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入水-甲醇溶液（50∶50，V/V）25 mL，超声处理（功率250 W，45 kHz）30 min。放冷后离心5 min（13 000 r·min-1，离心半径为7.5 cm），取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察用移液管移取“2.2”项下的刺五加苷B和刺五加苷E对照品储备液适量，置于同一5 mL容量瓶中，用水-甲醇（50∶50，V/V）配制成系列混合对照品溶液（刺五加苷B 质量浓度为10、20、40、100、200 和400 μg·mL-1；刺五加苷E 质量浓度为5、10、20、50、100 和200 μg·mL-1），按“2.1”项下色谱条件依次进样，记录峰面积，绘制标准曲线，得刺五加苷B和刺五加苷E回归方程分别为：Y=5.615×104X-3.075×105（r=0.999 0），Y=4.877×104X-9.360×104（r=0.999 1）。结果表明，刺五加苷B和刺五加苷E 在10～400、5～200 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验精密吸取“2.4”项下制备的混合对照品溶液（刺五加苷B质量浓度为100 μg·mL-1，刺五加苷E 质量浓度为50 μg·mL-1）200 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果显示刺五加苷B和刺五加苷E 峰面积的RSD 分别为0.5%和1.3%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一批次（批号：2023001）的供试品溶液200 μL，于室温条件下，分别于制备后0、2、4、6、8、12 和24 h 测定。结果刺五加苷B和刺五加苷E峰面积的RSD 分别为0.6%和2.4%，表明该方法具有良好的稳定性。

2.7 重复性试验取同一批次（批号：2023001）的刺五加样品6 份，分别按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液。取供试品溶液200 μL，进样测定，记录峰面积，并计算刺五加苷B和刺五加苷E的含量。结果刺五加苷B和刺五加苷E 的含量平均值（n=6）分别为0.129%和0.073%，RSD（n=6）分别为2.8%和2.6%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验精密称取已知含量的刺五加样品溶液（刺五加苷B和刺五加苷E 的含量分别为0.129%和0.073%）共9份，每份1.0 g，分别加入相当于样品中刺五加苷B和刺五加苷E 含量的80%、100%、120%的对照品溶液适量，各3 份，制备供试品溶液。进样测定，记录峰面积，计算刺五加苷B和刺五加苷E的回收率和RSD。结果见表1。

表1 刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E 的回收率（n=9）Table 1 Recoveries of eleutheroside B and eleutheroside E in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis（n=9）

2.9 样品含量测定取6 批次刺五加样品，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，采用外标法计算刺五加苷B和刺五加苷E 的含量。6 批样品测定结果见表2。

表2 刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E 的含量测定结果（%，n=3）Table 2 Content determination of eleutheroside B and eleutheroside E in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis（%，n=3）

3 讨论

3.1 流动相的优化本实验先后考察了3种不同流动相体系（水-乙腈、0.1%磷酸水-乙腈和水-甲醇）的分离效果。当采用乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水作为流动相时，刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E无法与药材中其他干扰成分分离。当采用水-甲醇作为流动相时，分离效果较好，与已有的研究[20-23]相比，分析时间明显缩短，仅为8 min，其他成分不干扰药物的测定。

3.2 检测波长的选择对刺五加苷B和刺五加苷E进行全波长扫描，刺五加苷B 在220 nm 和264 nm 波长处有最大吸收峰，其中，在220 nm 波长处吸收强度较高，刺五加苷E 在206 nm 波长处有最大吸收峰。为减少杂峰干扰，获得较好的分离度，并考虑基线平稳、色谱峰响应和末端吸收等因素，最终选择紫外215 nm作为检测波长。

3.3 提取溶剂的选择《中国药典》（2020年版）中记载的刺五加供试品溶液的制备方法为超声提取法，采用的提取溶剂为100%甲醇[1]。本研究采用100%甲醇作为提取溶剂进行提取时，刺五加苷B提取效果较好，但由于刺五加苷E在甲醇中溶解度较差，提取效果不佳，且峰形较差。采用甲醇-水（50∶50，V/V）作为提取溶剂时，刺五加苷B和刺五加苷E提取率均较高，且药材中其他成分干扰较小。因此，本实验最终选择甲醇-水（50∶50，V/V）作为提取溶剂。

本研究建立了UFLC 法同时测定刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E 的含量，相比于HPLC 法，本方法缩短了分析时间，并保证了较好的分离度和较高的灵敏度。应用本方法测定了6批刺五加药材中刺五加苷B和刺五加苷E的含量，结果显示，均符合《中国药典》（2020年版）刺五加苷B 不得少于0.050%的要求。本方法具有专属性强、准确度高、重复性好、分析时间短等特点，可为刺五加药材的质量控制和体内药动学研究提供参考。