冠心病合并2型糖尿病发病与CCL21基因rs2812377多态相关性研究

程茗慧, 刘 丹, 宋海旭, 闫承慧, 张效林

北部战区总医院寒地心血管病全国重点实验室 心血管内科,辽宁 沈阳 110016

冠心病是动脉血管壁慢性炎症反应性疾病［1］,炎性因子可以诱发糖类和脂质成分的积聚沉积在动脉粥样硬化的血管壁,导致动脉粥样硬化斑块破裂,进一步导致冠状动脉内血栓的形成。糖尿病是冠心病患者的主要致病因素之一。有研究报道,冠心病合并2型糖尿病的发病率呈逐年增高的趋势,因而,在临床上对冠心病合并2型糖尿病的防治十分重要［2-3］。冠心病合并2型糖尿病的发病机制目前尚不清楚,有研究发现,冠心病合并2型糖尿病作为一种复杂的代谢性疾病,冠状动脉血管壁的慢性炎症反应在此过程中发挥着重要的作用［4］。趋化因子CCL21通过募集血液中单核细胞等炎症细胞进入病变区域参与机体免疫系统炎症反应性疾病。趋化因子受体7(chemokine receptor 7,CCR7)是趋化因子CCL21的一个受体分子［5］。Damas等［6］研究发现,冠心病患者中趋化因子CCL21表达水平较正常对照者明显增高。同时,Luchtefeld等［7］发现,CCL21-/-LDL-/-小鼠Western diet喂养16周后,CCL21的表达缺失可以减缓动脉粥样硬化的发展。CCL21作为一种趋化因子为CCR7受体的配体,在发挥趋化因子引起冠状动脉血管壁炎症反应的同时,激活CCR7受体引起动脉粥样硬化血管壁的免疫炎性反应［8-10］。本研究旨在探讨冠心病合并2型糖尿病的发病与CCL21基因rs2812377多态位点的基因频率的改变是否存在相关关系,进一步分析CCL21基因rs2812377多态与冠心病合并2型糖尿病患者血浆中CCL21表达水平是否相关。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2009年3月至2011年9月北部战区总医院心血管内科收治的225例冠心病合并2型糖尿病患者为研究对象,并设为冠心病合并2型糖尿病组。纳入标准:空腹血糖≥7.0 mmol/L,或者餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L;均经冠状动脉造影检查。同时,纳入因胸痛入院但冠状动脉造影证实其冠状动脉主支无狭窄且不满足糖尿病诊断标准的95例患者设为正常对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准。所有研究对象均知情并签订知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集 对入选的冠心病合并2型糖尿病患者及正常对照人群,由专门从事本项目研究的科研工作人员询问病史。同时,收集两组研究对象的血浆生化指标及心肌酶学的情况。

1.2.2 样本的采集 两组研究对象均在清晨空腹状态下采集静脉血,摇匀,储存在-20℃冰箱,用封口膜封闭保存。

1.2.3 血浆中CCL21浓度的检测 按照美国RD公司生产的CCL21酶联检测试剂盒说明书建立趋化因子CCL21检测的标准曲线。CCL21血浆浓度的检测采用96孔上样板,经过上样、孵育、反复冲洗、显色后,在酶标仪上检测待测定的冠心病合并2型糖尿病患者及正常对照人群血浆中的CCL21的表达。

1.2.4 DNA提取 将冻存的静脉血室温放置后,加入到15 ml尖头离心管中,离心10 min(3 000 r/min);裂解红细胞;加入10% SDS 0.5 ml,10 mg/ml蛋白酶K 50 μl,37℃、18～20 h。引物设计和合成由上海生工生物技术有限公司完成。利用美国BIO-RAD公司生产的热循环仪对CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点进行聚合酶链反应扩增工作,整个扩增体系为50 μl,其中,包含冠心病合并2型糖尿病患者225例及正常对照样品95例基因组的DNA,同时,在扩增体系内加入dNTP、聚合酶链反应缓冲液、上下游引物和rTaq酶。进行聚合酶链反应,待反应结束后,将待检测样品取出送到上海生工生物工程有限公司进行聚合酶链反应产物的测定。

1.3 Mass array技术分析CCL21基因rs2812377单核苷酸多态基因型的频率 应用Mass array飞行质谱分析仪对CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点3个基因型TT/GT/GG特点进行分析验证。

2 结果

2.1 两组研究对象一般资料比较 两组研究对象的性别比例、高血压比例、吸烟比例、体质量指数,以及总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

2.2 CCL21 rs2812377多态基因型及等位基因分布频率比较 趋化因子基因 CCL21 rs2812377多态位点存在TT型、GT型和GG型3种基因型。两组研究对象的趋化因子基因CCL21 rs2812377多态位点TT型、GT型和GG型3种基因型频率比较,差异均有统计学意义［P<0.05,OR=1.62(95%可信区间1.14～2.29)］。见表2。正常对照组T等位基因、G等位基因的分布频率分别为44.21%(84/190)、55.79%(106/190);冠心病合并2型糖尿病组T等位基因、G等位基因的分布频率分别为33.78%(152/450)、66.22%(298/450)。两组T等位基因、G等位基因的分布频率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 CCL21 rs2812377多态基因型分布频率比较/例(百分率/%)

2.3 冠心病合并2型糖尿病患者血浆中CCL21表达水平与rs58801单核苷酸多态关联分析 分别收集35例冠心病合并2型糖尿病患者及20例正常对照组研究对象的血浆标本,其中,冠心病合并2型糖尿病患者CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点TT+GT和GG位点的入选样本例数分别为18例、17例,正常对照组分别为11例、9例。冠心病合并2型糖尿病组血浆中CCL21水平为(844.73±146.82)pg/ml,高于正常对照组的(507.77±103.62)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。冠心病合并2型糖尿病组血浆中TT+GT基因型携带者血浆CCL21水平为(800.31±120.21)pg/ml,低于GG型基因型携带者的(925.79±129.90)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组TT+GT基因型及GG基因型携带者血浆CCL21水平分别为(517.81±134.25)pg/ml、(495.50±63.31)pg/ml,两种基因型比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

冠心病发病受遗传、环境等危险因素的影响,血浆血糖水平升高也是冠心病发病的重要危险因素之一,糖代谢产生异常是导致动脉粥样硬化斑块发生发展的重要原因［3-4］,降低冠心病合并2型糖尿病患者不良心血管事件的发生率对于心血管疾病的防治十分重要［5-6］。

冠心病合并糖尿病患者的动脉粥样硬化是一种血管壁慢性炎症反应性疾病,同时合并血液中血糖水平的增高及胰岛素抵抗的一种代谢性疾病。作为一种慢性炎症反应性疾病,血液循环中的单核细胞等炎性细胞从血液循环向受损的血管壁募集是动脉粥样硬化病变发生的始动环节［7］。免疫系统激活的炎症反应在冠心病发病过程中发挥重要的作用,CCL21能够趋化血液循环中的单核细胞移行进入动脉血管壁,引起动脉血管壁慢性炎症反应,导致血液循环中的脂质沉积在动脉血管壁,造成动脉粥样硬化斑块的进展和不稳定斑块的形成［8-10］。趋化因子CCL21通过与其受体CCR7结合后,诱导免疫细胞的激活,并引起机体免疫耐受反应的发生。有研究报道,给与CCL21-/-/ApoE-/-双基因敲除的小鼠Western diet喂养后,小鼠的动脉粥样斑块面积明显减少,同时出现免疫细胞调节功能紊乱的现象［11-15］。因此,对趋化因子CCL21与其受体CCR7的研究对冠心病合并2型糖尿病的免疫治疗具有重要的临床意义。

目前,关于趋化因子CCL21基因单核苷酸多态性与冠心病相关关系的研究报道较少见。本研究对CCL21基因rs2812377基因多态位点进行病例-对照研究,结果显示,CCL21基因rs2812377不同基因型携带者血浆中CCL21表达水平在冠心病合并2型糖尿病患者中表达明显上调。进一步分析CCL21基因rs2812377多态位点等位基因的频率分布特点显示,T等位基因在冠心病合并2型糖尿病人群的分布频率为33.78%,低于对照人群的44.21%,差异有统计学意义分(P<0.05);而G等位基因在冠心病合并2型糖尿病的分布频率为66.22%,高于对照人群的55.79%,差异均有统计学意义(P<0.05)。这说明,CCL21基因 rs2812377多肽位点G等位基因与冠心病合并2型糖尿病的发生存在相关关系,可能是冠心病合并2型糖尿病发病的独立危险因素。

本研究存在的局限性:本课题组前期研究已经发现CCL21基因rs2812377多态位点与冠心病的发病存在相关关系,应该在急性心肌梗死患者中进一步印证CCL21基因rs2812377多态位点是否与急性心肌梗死的发病存在相关关系。同时,未来需要在体实验对CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点G/T等位基因进行突变分析,分别观察G等位基因和T等位基因的突变对冠心病合并2型糖尿病的模型鼠的发病是否存在相关关系。

综上所述,趋化因子CCL21表达水平在冠心病合并2型糖尿病患者血浆中明显上调,CCL21基因rs2812377多肽位点G等位基因可能是冠心病合并2型糖尿病发病的危险因素。