富血小板血浆及其复合银离子的体外抑菌效果研究

刘胜杰 马武秀 陈聪聪 张淦 吴旅 陈肖松

难愈性创面指无法通过正常、有序、及时的修复过程恢复解剖和功能上完整状态的创面［1］，易引发细菌感染。由于局部血供受损，静脉药物治疗难以到达损伤部位，创面局部外用治疗方案较静脉药物治疗更为直接和有效。富血小板血浆（plateletrich plasma，PRP）富含加速创面修复的血小板衍生因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor，IGF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等生长因子［2］。Cetinkaya等［3］研究表明，PRP有一定的体外抑菌效果，但各文献对于PRP的抑菌谱及抑菌效果尚无明确定论。银离子作为临床较为常用的体外抗菌材料，具有灭菌效率高、不易诱发细菌耐药等优点［4］。因不具备生物活性，银离子对难愈性创面修复的治疗效果有限。本研究旨在观察PRP及其复合银离子后对临床常见细菌的抑菌效果，以及银离子对复合物中PRP释放生长因子能力的影响，为临床治疗难愈性创面提供新的更加高效的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 金黄色葡萄球菌标准株（编号ATCC25923）、大肠埃希菌标准株（编号ATCC25922）、铜绿假单胞菌标准株（编号ATCC27853），实验菌株由中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院检验科提供。

1.2 实验材料及仪器 硝酸银固体（Sigma-Aldrich）、一次性注射器（1 mL、5 mL，江苏苏云）、营养琼脂培养基平板（90 mm，环凯微生物）、高精度电子天平（安徽中科中佳）、立式压力蒸汽灭菌器（登冠医疗） 、麦氏比浊仪（梅里埃）、电热恒温培养箱（上海力康）、PRP制备套装（山东威高） 、高速离心机（山东威高）、全自动血细胞分析仪（迈瑞BC-3000）、ELISA试剂盒（南京森贝伽）、全自动酶免仪（深圳爱康Uranus AE280）等。

1.3 菌种培养及保存 在无菌操作台对实验菌种进行复苏、转种并37℃培养24 h。用一次性接种环挑取培养24 h的3种细菌置于缓冲液中，校正浊度为0.5麦氏单位，备用。

1.4 富血小板血浆的制备 血样采自10名健康志愿者（年龄20～32岁），威高PRP套装中采血管空腹采集每名志愿者肘部静脉血52 mL后，取2 mL血样测血小板浓度均处于正常范围，剩余50 mL对称置入高速离心机，制备PRP。

1.5 硝酸银溶液的制备 电子天平秤取硝酸银固体10 mg，置入1 000 mL圆底烧瓶后加入少量无菌水，用玻璃棒搅拌，使其溶解。继续添加无菌水至1 000 mL刻度线，根据最佳抑菌浓度，制成银离子浓度为10 ppm的硝酸银溶液。将制备完成的硝酸银溶液移入棕色玻璃瓶保存。

1.6 分组 抑菌实验：根据抑菌材料分为对照组（1 mL PBS缓冲液）、PRP组（1 mL PRP）、银离子组（1 mL硝酸银溶液）、复合组（0.5 mL PRP+0.5 mL硝酸银溶液），各组每种细菌分别涂布4个平板（共计48板）。生长因子检测：为避免复合银离子后样本稀释对生长因子浓度测定的影响，样本分为无干扰PRP组（1 mLPRP+1 mL PBS缓冲液）、PRP+银离子组（1 mL PRP+1 mL银离子溶液），每组标本各10份，重复测量3次，取平均值。

1.7 抑菌实验及观察指标 用1 mL一次性注射器分别抽取0.1 mL金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及大肠埃希菌菌悬液，均匀涂布在琼脂平板上。再用5 mL注射器抽取每组所需抑菌材料，依次均匀涂布在带菌平板上。涂布完成的平板放入37℃恒温培养箱，分别于12 h、18 h、24 h、36 h以及48 h后观察平板细菌生长情况并记录结果。无细菌或少量细菌生长记为“-”；1∕4板记为“+”；1∕2板记为“2+”；3∕4板记为“3+”；满板记为“4+”。

1.8 生长因子测定 取PDGF、TGF-β、VEGF试剂盒，按照试剂盒检测说明书配制好所有试剂。两组标本按照试剂盒说明书所要求完成实验操作。在450 nm波长下使全自动酶免仪测定，并制作相应标准曲线，计算生长因子浓度。

1.9 统计学方法 采用SPASS 26.0进行统计分析，正态分布计量资料用表示，两组间均数比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 制备PRP样本数据 健康志愿者全血中血小板计数为（187.0±21.0）×109∕L，白细胞计数（7.5±0.9）×109∕L；制备成PRP后，血小板计数为（955.0±112.0）×109∕L。

2.2 金黄色葡萄球菌抑菌实验结果 37℃条件下，培养12 h后，对照组、PRP组出现细菌生长及满板，18 h之后两组所有平板细菌生长情况均为满板。培养12 h、18 h后，银离子及复合组未见明显细菌生长，24 h后，两组出现细菌生长，36 h后仍未出现满板情况，在48小时所有平板细菌生长情况均为满板。见表1，图1。

图1 金黄色葡萄球菌培养基生长情况

表1 各组对金黄色葡萄球菌的抑菌效果对比

2.3 大肠埃希菌抑菌实验结果 37℃条件下，培养12 h后，对照组、PRP组出现细菌生长，18 h后两组细菌生长出现满板，24 h之后均为满板。培养12 h、18 h及24 h后，银离子及复合组未见明显细菌生长，在36 h，两组出现细菌生长，至48 h仍未出现满板情况。见表2，图2。

图2 大肠埃希菌培养基生长情况

2.4 铜绿假单胞菌抑菌实验结果 37℃条件下，培养12 h后，对照组、PRP组出现细菌生长，18 h两组出现满板，24 h之后两组细菌生长情况均为满板。培养12 h、18 h后，银离子及复合组未见明显细菌生长，24 h后，两组出现细菌生长，36 h未出现满板情况，在48 h所有平板细菌生长均为满板。见表3，图3。

图3 各组对铜绿假单胞菌抑菌效果

表3 各组对铜绿假单胞菌的抑菌效果对比

2.5 PRP及PRP复合银离子后生长因子检测结果银离子与PRP复合后所检测到的PDGF、TGF-β、EGF以及VEGF生长因子浓度均小于PRP组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 两组生长因子浓度比较(，ng/L)

表4 两组生长因子浓度比较(，ng/L)

注：PRP为富血小板血浆, PDGF为血小板衍生因子,TGF-β为转化生长因子-β,EGF为表皮生长因子,VEGF为血管内皮生长因子。

组别PRP组复合组t值P值VEGF 1 081.15±21.63 1 079.00±13.83 0.265 0.794样本量（个）10 10 PDGF 316.12±3.08 315.16±3.19-0.689 0.499 TGF-β 3 060.00±18.93 3 051.98±19.44 0.935 0.362 EGF 4 670.61±30.05 4 658.75±62.10 0.544 0.593

3 讨论

PRP是一种血液浓缩制成的具有生物活性的物质，富含远高于循环血液浓度的血小板［5］。一方面，PRP可释放对高浓度组织再生和修复至关重要的PDGF、TGF-β、EGF、VEGF等，调节免疫系统，触发组织的细胞再生过程［6］；另一方面，血浆为再生提供了纤维蛋白支架，并在创面愈合过程中维持增殖和氧化稳态［7］。因此，PRP生物活性主要应用在促进组织修复以及创面愈合方面，而其应用效果主要与释放生长因子的浓度密切相关。同时，国内外文献报导PRP对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌等具有一定的抑菌作用［8-9］，但对于同一种细菌，不同的文献甚至出现有效和无效两种截然不同的结论［10-11］，其抑菌作用尚有争议。本研究通过体外抑菌试验探究PRP的抑菌效果，结果显示单纯PRP的体外抑菌试验在12 h内即出现细菌生长及满板，与对照组相比未表现出明显的抑菌效果。

为达到更稳定的抑菌效果，武钰翔［12］将莫西沙星负载于富白细胞-血小板纤维蛋白（leukocyte-rich platelet fibrin，L-PRF）中进行体外抑菌实验。因为PRP中含有大量的纤维蛋白，为细胞的生长提供良好支架的同时，还为复合各类协同材料提供了结构基础［13］：与单纯L-PRF未表现出明显的抑菌效果相比，负载莫西沙星后的L-PRF对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌具有明确的抑菌作用。但是随着抗生素在临床的大量使用，细菌的耐药问题愈发严重，负载抗生素增强抑菌效果无法满足临床需要，亟需一种新的抑菌材料加以复合。

银离子作为一种抗菌材料或者物质，其主要通过干扰细胞壁的合成、损伤细胞膜、抑制蛋白质的合成、干扰核酸的合成等途径达到抑菌效果。银离子可与细胞质膜相互作用，破坏电子转移和质子驱动力，使其失活；银离子还可与膜内巯基（-SH）、氨基（-NH2）等含硫、氨的官能团反应，破坏细胞合成酶活性，最终导致细胞死亡。此外，暴露在空气或水中的银离子能够激活其中的氧，产生活性氧离子（O2-），破坏细菌繁殖能力，达到抗菌效果［14］；同时因为不易产生耐药性，银离子被广泛应用于各种抗菌敷料中［15］，在创面感染的防治中发挥重要作用。孙建斐等［16］利用体外细胞毒性噻唑蓝法对不同浓度银离子溶液的细胞毒性进行检测，结果显示，浓度达到10 ppm的银离子溶液即具有极强的抑菌效果，浓度超过12.5 ppm其细胞毒性才会明显增加，当银离子浓度低于12.5 ppm时对细胞不会产生损害。因此本研究采用PRP复合10 ppm浓度的银离子溶液进行体外抑菌实验。

在生物安全性方面，硝酸银早在1965年就被用于烧伤创面的局部治疗［17］。陈炯等［18］在临床研究中发现，与对照组相比，患者在应用银敷料后的第3～5天血清银及尿银水平有所升高，但在14天后恢复至正常，患者的肝肾功能无损害，且电镜观察创面组织未发现银沉积现象。另有文献提出，当银离子与完整的皮肤接触时不会造成人体血液中银离子含量增加，银离子也不会对眼睛和皮肤造成刺激［19］。

本次体外抑菌试验证明，在36 h内，银离子对临床常见的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌均有良好的抑菌效果，最长抑菌时间可达48 h。但由于其作为化学材料的局限性，银离子仅能通过杀灭细菌、防止细菌在创面定植产生细菌生物膜，消除创面愈合的不利因素，改善愈合环境，从而达到间接促进创面愈合的作用。对整个创面愈合过程而言，银离子并不直接参与组织修复，因此其对难愈型创面的治疗效果有限。

探究PRP与银离子复合后的抑菌效果以及其对PRP释放生长因子能力的影响，可为临床对难愈性创面的治疗提供新思路。本研究结果显示，相较于对照组，PRP复合银离子后表现出良好的抑菌效果，在24 h内，3种细菌均未见明显生长，其中复合物对大肠埃希菌的抑菌作用在48 h后仍未消失，证明其对大肠埃希菌具有更好的抗菌效应，且与单纯银离子组相比，两组的体外抑菌结果未表现出明显差异。

目前虽已有关于PRP的抗菌试验，但都是针对单一菌种，本实验针对的菌种较多，可横向分析银离子及其复合PRP抑菌效果。同时少有PRP联合其他材料的体外抑菌研究，更无联合银离子的体外抑菌试验。其原因可能出于对银离子或许会干扰PRP本身生长因子释放的顾虑，为验证银离子复合PRP后对其生物活性的影响，本研究进行了相关生长因子浓度检测。

在对单纯PRP组以及复合组PDGF、TGF-β、EGF、VEGF的浓度检测中，复合组4种生长因子浓度均小于单纯PRP组，但两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究证实了PRP与银离子复合后，银离子对PRP释放生长因子的能力无明显负面影响。宋瑞捧等［20］在生长因子复合含银敷料治疗感染创面的临床研究中表明，银离子不会对生长因子的生物活性产生影响，且不会造成银中毒。

综上所述，PRP复合银离子对临床常见的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌皆具有明确的抑菌作用，同时银离子对PRP中生长因子的释放无明显影响。本研究证实了PRP与银离子复合的可行性：两者的复合物在充分利用PRP的组织再生修复作用的同时，亦能发挥银离子的抗菌效应。参照临床对于感染性难愈型创面的隔日换药治疗方法，PRP与银离子复合后的36 h抗菌时长能够满足治疗需要，为临床治疗伴随感染的难愈型创面提供可行的方法与思路。本研究仍存在一些不足：复合组PRP与银离子本次的比例为1∶1，后续可采用其他比例复合，探究两者复合的最适比例；实验仅为体外抑菌试验，对于真实创面的效果未知，有待进一步研究确认，但本实验结果可为后期动物试验提供一定参考。