新疆某奶牛场犊牛腹泻病原菌检测及鉴定

刘英玉,郑晓琴,李瑞鹏,朱明月,胥 兰,邵 伟,郑晓风,苏战强*,姚 刚

(1.新疆农业大学 动物医学学院,新疆 乌鲁木齐 830052;2.新疆农业大学 动物科学学院,新疆 乌鲁木齐 830052)

犊牛腹泻可造成大批的犊牛死亡,给养殖业带来较大的经济损失。据估计,在犊牛的早期死亡病因中,断奶前犊牛急性腹泻占75%左右,成为奶牛高死亡率和发病率的原因之一[1-2],有报道由沙门氏菌引起的犊牛腹泻约占犊牛腹泻病的10%～12%[3]。沙门氏菌感染可能发生在牛的任何年龄段,但在2周龄到3个月龄犊牛引起严重的临床症状[4-5]。引起犊牛腹泻的原因较复杂且病原众多,有细菌、病毒、寄生虫等,且不同类型的病原之间又存在不同程度的混合感染,从而导致对该病的防控难度增加。近年来,犊牛腹泻的发病率和病原菌的耐药程度也逐年上升[6],明确引起犊牛腹泻的病因及病原的耐药情况对犊牛腹泻的治疗及防控具有一定的指导意义。冬季犊牛腹泻的发生多是条件性致病菌引起,因此对新疆某规模化奶牛场腹泻犊牛粪便进行病原菌的分离鉴定和药敏性的检测,为探究犊牛腹泻病原菌的流行状况和筛选出有效防治该场犊牛腹泻病提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

用灭菌棉棒采集新疆某奶牛场腹泻犊牛的粪样,共采集腹泻样本49份,装于灭菌的离心管中,低温带回实验室。

1.2 主要试剂与仪器

缓冲蛋白胨水(buffered peptone water, BPW),木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(xylose lysine desoxycholate, XLD)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(tatrathionate broth, TTB)均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;革兰氏阴性药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司;生化鉴定试剂盒购自青岛海博生物技术有限公司。TAE购自北京鼎国昌盛有限公司;Taq MasterMix、DNA Marker、T载体、DH5α购自Takara生物公司。

1.3 菌株

大肠杆菌质控菌ATCC25922购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.4 病原菌的分离鉴定

按照国家标准方法食品微生物学检验 沙门氏菌检验(GB 4789.4-2016),分别取腹泻样本1 mL加入到9 mL的BPW中,置于37 ℃恒温摇床中以180～200 rpm增菌18～24 h。取BPW中的菌液1 mL至TTB增菌液中,置于37 ℃恒温摇床中以180～200 rpm再增菌18～24 h。后将增菌液分别划线接种至XLD琼脂上,置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h。挑取XLD上带黑心的菌落穿刺至三糖铁琼脂中,再接种至赖氨酸脱羧酶肉汤、氰化钾、尿素酶、蛋白胨水中,置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h,必要时延长至48 h。结果按照生化试剂盒中的颜色进行判断。

1.5 DNA模板制备

根据生化鉴定的结果挑取单菌落于1 000 μL营养肉汤中,放入37 ℃恒温摇床中培养18～24 h。使用煮沸法提取DNA模板[7],取700 μL的菌液加入1.5 mL EP管中,12 000 rpm离心10 min,弃上清,再加入50 μL灭菌ddH2O吹吸混匀,100 ℃水浴10 min后,置于冰上10 min,12 000 rpm离心5 min,取上清保存于-20 ℃冰箱备用。

1.6 病原菌16S rRNA的扩增

16S rRNA引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列是16S-F AGAGTTTGATCCTGG CTCAG和16S-R GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反应体系(25 μL):2 Taq Master Mix 10 μL;上下游引物各0.5 μL,模板1 μL,dd H2O 13 μL。PCR反应条件为预变性94 ℃ 5 min;变性温度94 ℃ 30 s,退火温度54 ℃ 45 s,延伸温度72 ℃ 5 min,循环数为35。4 ℃保存产物。

1.7 PCR产物的鉴定和测序

将PCR的扩增产物5 μL用1%琼脂糖进行电泳,用凝胶成像系统判定PCR产物检测的结果。将PCR的阳性扩增产物胶回收后连接到PMD18-T载体上,转入DH5α,操作按照说明书进行。经PCR鉴定正确后提取重组质粒DNA模板20 L送至上海生工测序,测序结果用NCBI数据库进行Blast比对和Lasergene软件的MegAlign制作进化树。

1.8 药物敏感性试验

按照美国临床试验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的手册[8]的Kirby-Bauer纸片扩散法对分离的菌株进行6大类17种药物耐药性检测。青霉素类(氨苄西林,哌拉西林);头孢菌素类(头孢呋辛、头孢西叮、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟);β-内酰胺类(氨曲南);氨基糖苷类(链霉素、妥布霉素、卡那霉素);喹诺酮类(氧氟沙星);大环内酯类(麦迪霉素)。用大肠杆菌ATCC 25922作质控菌株,判定标准按美国NCCLS操作标准。药敏结果用Excel 2013软件进行分析。

1.9 动物试验

购买新疆医科大学动物试验中心昆明小白鼠(25±3)g,准备过夜培养的菌液(108CFU/mL)进行灌胃,通过动物存活情况观察菌株对小白鼠的致病性。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离鉴定结果

通过增菌后在选择性培养基XLD表面有8株带黑心的典型菌落,检出率为16.32%。8株病原菌生化鉴定结果见表1。三糖铁斜面穿刺后有8株菌株均能产H2S气体,6株菌株靛基质阴性,2株靛基质阳性;8株菌株赖氨酸脱羧酶均呈阳性,8株菌株在氰化钾中均不生长;8株菌株中有1株不分解尿素,其余均能分解尿素。按照食品微生物学检验沙门氏菌检验(GB 4789.4-2016)判定7株为个别变体,1株为沙门菌属。

表1 病原菌生化鉴定结果Table 1 Results of biochemical identification of some pathogenic bacteria

2.2 病原菌16S rRNA的测序结果

将8株病原菌的16S rRNA的测序结果在NCBI数据库进行Blast比对,生化鉴定为沙门菌属的H186菌株与都柏林沙门菌(Salmonella enterica Dublin)的同源性最高达到100%,与副伤寒沙门菌(Salmonella enterica Typhimurium)和印第安纳沙门菌(Salmonella enterica Indiana)的亲缘关系接近,为99.9%,结果如图1所示。生化鉴定为个别变体的7株病原菌,其中一株菌H170与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的同源性达到99.9%,与霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)的同源性达到99.7%,其余六株菌H176、H157、H179、H150、H145、H147与奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的同源性达到100%。8株菌株的进化关系如图1所示。

图1 8株菌株16S rRNA的进化分析Fig.1 16S rRNA evolution analysis of 8 strains

2.3 病原菌的耐药性结果

对分离鉴定的8株病原菌进行5大类17种抗生素检测,检测结果显示都柏林沙门菌H186只对麦迪霉素耐药,仅对链霉素和头孢噻肟中介,对其他药物均敏感(见表2)。阴沟肠杆菌H170耐药数量达到了8种,分别是氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛、头孢哌酮、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、麦迪霉素;对头孢噻吩、头孢曲松、头孢噻肟等抗生素是中介;其余六株奇异变形杆菌(H176、H157、H179、H150、H145、H147)对麦迪霉素和头孢呋辛的耐药率为100%、对氨苄西林和头孢哌酮的耐药率为66.67%)、对哌拉西林的耐药率为50%、对头孢唑林、头孢噻肟、链霉素、妥布霉素的耐药率为33.33%、对头孢噻吩、头孢曲松、卡那霉素的耐药率为16.67%;对头孢他啶、头孢西叮、氧氟沙星是不耐药的。耐药数量结果显示,除了都柏林沙门菌H186是耐一种抗菌药外,阴沟肠杆菌H170和奇异变形杆菌(H176、H157、H179、H150、H145、H147)的耐药现象严重,最多可耐12种抗菌药,最少的也是耐3种抗菌药物。

表2 菌株的耐药情况Table 2 Drug resistance of strains

2.4 动物试验结果

选取阴沟肠杆菌H170和奇异变形杆菌H150、都柏林沙门菌H186进行小白鼠致病性试验,灌胃前12 h禁食禁水,分别给昆明小白鼠灌胃1.5 mL 108CFU/mL的菌液,灌胃后4 h给予鼠粮和饮水,都柏林沙门菌H186在1 d后出现死亡,奇异变形杆菌H150在2～3 d出现死亡,阴沟肠杆菌H170观察7 d没有出现死亡。

3 讨 论

犊牛腹泻病为制约犊牛生长繁殖的重要疾病之一。王胜义[9]报道西北地区犊牛腹泻病的病原主要是细菌,该奶牛场犊牛发生腹泻后按照细菌的分离鉴定,最后通过16S rRNAc测序确定该场犊牛腹泻样品中存在都柏林沙门菌和奇异变形杆菌。李海梅等[10]报道,青海西宁某牛场中由沙门菌引起的腹泻犊牛22%。王继军等[11]报道,新疆库尔勒地区某牛场爆发犊牛腹泻经诊断为沙门菌感染。沙门氏菌是引起犊牛腹泻的一种重要的病原菌之一,在本试验中分离出1株都柏林沙门氏菌,都柏林沙门氏菌是一种适应宿主的血清变种,通常感染牛。因此根据分离结果在治疗过程中不能忽视。本次检测结果病原菌存在较多的奇异变形杆菌,目前奇异变形杆菌的流行趋势不断扩大,奶牛、猪、鸡、孔雀、貂、狐狸等家畜和特种动物感染奇异变形杆菌的报道屡见不鲜,已成为导致人和动物感染的重要条件致病菌,该病的发病趋势应引起兽医界重视[6]。奇异变形杆菌属于肠杆菌科变形杆菌属,为无荚膜、无芽孢的革兰氏阴性杆菌,该细菌在自然界分布较广,可存在于粪便、污水、土壤当中[12]。本试验从其母源粪便中没有检测出病原菌,所以推断不是垂直传播感染,提示该场中引发的犊牛腹泻可能由外界环境中带来。

沙门氏菌感染表现出临床症状的牛更易产生多重耐药的菌株[13],McEvoy等[14]分离的沙门菌对氨苄西林、氯霉素、链霉素有耐药性,其中都柏林沙门菌对所有抗生素敏感。本次检测结果显示,都柏林沙门氏菌只对麦迪霉素耐药,对链霉素以及头孢噻肟中度敏感,对其余的抗生素呈现高度敏感。本次检测结果与相关报道相似,造成差异的原因可能与不同血清型的沙门氏菌对这些抗生素的敏感程度不同。而分离鉴定的奇异变形杆菌和粪肠球菌几乎都对氨苄西林、头孢呋辛、头孢哌酮、链霉素、妥布霉素、麦迪霉素、哌拉西林显示出耐药性且呈现严重的多重耐药的情况。因此,考虑到抗生素是防治人和动物细菌性疾病最重要的治疗工具,在避免细菌产生耐药性以确保治疗效果的前提下应谨慎使用抗菌药物是非常必要的。

4 结 论

从49份犊牛腹泻样本检测出8株病原菌,检出率为16.32%。经16S rRNA测序比对有1株都柏林沙门菌、1株阴沟肠杆菌、6株为奇异变形杆菌。病原菌具有不同程度的耐药。混合感染是引起犊牛腹泻的病因。