承德地区猪肉屠宰加工及零售环节中沙门氏菌的分离鉴定与耐药性检测

邱青璐,王 铄,王亚男,张召兴,,崔海明,张艳英

(1. 河北旅游职业学院,河北 承德 067000;2. 承德市农林科学院,河北 承德 067000;3. 河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室,河北 秦皇岛 066604)

沙门氏菌是一种危害人类健康的食源性致病菌,该菌通过污染肉、蛋、奶等食物和水源等途径感染[1]。沙门氏菌抗原结构复杂,目前具有2500多个血清型,在不同的宿主、地区及养殖场中流行不同的血清型,且不同血清型之间的菌株无交叉保护性[2]。伴随着临床中抗生素的不合理的使用,沙门氏菌耐药性问题已经很普遍,耐药菌株广泛存在给该病治疗与防控带来一定困难,同时沙门氏菌的耐药性可通过食物(肉、蛋、奶、蔬菜等)传播给人,潜在威胁着人类健康[3]。近几年,关于猪肉、鸡肉在屠宰加工及销售环节中沙门氏菌污染报道的越来越多。因此,对猪屠宰加工环节及销售环节中的沙门菌检测具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2021-2022年采集河北承德地区猪屠宰场加工厂及零售样品374份,其中生猪屠宰加工厂(刀具、容器、胴体、冲洗水等)159份,零售店铺及超市(案板、刀具、冰箱容器等)215份。

1.2 主要试剂

蛋白胨水、SS培养基、沙门氏菌显色鉴定培养基、沙门氏菌增菌液(TTB),均购自北京剑桥生物科技有限公司;临床中常用的抗生素的药敏纸片、API20E试剂盒,购自北京天坛药物生物技术开发公司;细菌基因组DNA试剂盒、2×Taq Master Mix、 DL 2000 Maker,均购自北京康为世纪生物科技有限公司;沙门氏菌属血清鉴定试剂盒,购自宁波天润生物药业有限公司。

1.3 试验动物

昆明系雄性小鼠960只(体重22～25 g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司,饲养于河北旅游职业学院畜牧兽医学院实训牧场。

1.4 细菌分离与培养

对采集猪屠宰场加工厂及零售样品经蛋白胨水处理后,接种于TTB中37 ℃震荡培养12～18 h,取培养物无菌接种于SS培养基进行鉴别培养,37 ℃恒温培养18～24 h后,挑取单个菌落接种于沙门氏菌显色培养基,37 ℃培养12～18 h,再挑取单个菌落接种于营养肉汤纯化培养,经镜检和形态学观察。

1.5 细菌生化鉴定

参照API20E试剂盒说明书,将分离菌株在无菌的条件接种于API20E试剂中,无菌条件下37 ℃培养12～18 h进行生化鉴定,并根据细菌编码表进行生化试验结果判读。

1.6 细菌PCR鉴定

参考文献[4]的方法,合成沙门氏菌保守区鉴定引物序列,引物invA为F1:5'-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3',F2:5'-AGACGACTGGTACTGATCGATAAT-3'。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,目的基因片段大小为241 bp,以提取分离菌株的基因组DNA为模板进行PCR鉴定,回收阳性的菌株的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果与GenBank中登录的参考株进行同源性比对。

1.7 致病性试验

参考文献[5]的方法,将分离菌株接种于营养肉汤中对数期并进行计数,调整菌液浓度为108CFU/mL,每株分离菌株腹腔注射5只昆明系小鼠,剂量为0.20 mL,对照组给予等量的无菌生理盐水。试验期为6 d,并观察小鼠发病情况。

1.8 血清型鉴定

按沙门氏菌属血清鉴定试剂盒说明书,用Kauffmann-White法对分离的沙门氏菌进行血清型鉴定。

1.9 药敏试验

试验结果判断参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2013年推荐的药敏试验法标准。取分离菌菌液(108CFU/mL)100 μL菌液在无菌的条件下均匀涂布在90 mm普通营养琼脂培养基并贴上药敏纸片, 37 ℃培养12～18 h后测定抑菌圈直径,取平均值。

1.10 耐药基因的检测

参考文献[6-7]的方法,合成沙门氏菌的耐药基因,主要包括β-内酰胺类耐药基因(tem、cmy、shv) 3种,磺胺类耐药基因(Sul1、Sul2、Sul3)3种,氨基糖苷类耐药基因(aac(3)-Ⅰv、aac(6')-Ⅰb)2种,喹诺酮类耐药基因(gyrA、gyrB、qurS)3种,四环素类(TetA、TetM、TetR)3种,酰胺醇类耐药基因 (floR)1种,多肽类(mcr-1)1种等7类抗生素16种耐药基因。以1.5提取的基因组DNA为模板用PCR方法进行耐药基因检测。并分析耐药性与耐药基因之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定

疑似沙门氏菌的菌株在SS培养基种长出边缘整齐、透明无色且中间带黑心的单个菌落;在沙门菌显色培养基上大小一致的蓝紫色菌落,染色镜检可见无荚膜、两端钝圆的阴性短杆菌。其培养特性与形态学与《伯杰细菌鉴定手册》报道的沙门氏菌培养特性、形态学及基本一致。参照API20E试剂盒说明书,对分离的疑似沙门菌菌株进行生化试验,191株分离菌株初步鉴定为沙门氏菌。

2.2 细菌PCR鉴定结果

用沙门氏菌鉴定引物invA对通过对初步鉴定的191株沙门菌,用PCR方法进一步鉴定,结果显示,191株沙门菌均扩增出大约为241 bp目的条带(见图1),经过测序分离的191株沙门菌测序结果与GenBank中登录的沙门氏菌参考株同源性在97.0%及其以上。根据判定结果分离菌株鉴定为沙门氏菌,分离率为51.1%(191/374)。

2.3 致病性试验

攻毒组小鼠在攻毒后2～3 d出现了精神沉郁、采食量减少等不同的发病情况,攻毒组的个别小鼠不表现任何症状出现急性死亡。剖检可见死亡的小鼠的肠道水肿、出血实质性器官出现不同程度出血。从死亡的小鼠体内分离得到沙门氏菌,对照组小鼠健康存活。本试验中,引起小鼠发病死亡的菌株有127株沙门菌,攻毒组小鼠的死亡率在40%～100%,表明引起小鼠发病死亡的127株沙门氏菌为致病性沙门氏菌。

2.4 细菌血清型鉴定

由表1可知,127株沙门氏菌中有13种血清型,其中以猪霍乱沙门氏菌(26.0%)、鼠伤寒沙门氏菌(20.5%)、伦敦沙门氏菌(17.3%)为该地区猪肉加工及零售环节中沙门氏菌流行优势血清型。

表1 127株沙门氏菌分离菌株的血清型检测结果Table 1 Serotype identification results of 127 Salmonella isolates

2.5 耐药性检测结果

由表2可见,分离的127株株致病性沙门氏菌对临床中常用的药物产生不同的耐药性,其中对氨苄西林、阿莫西林、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噁唑啉、磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素、土霉素、新霉素8种药物耐药率在56.7%～95.3%之间,对头孢噻呋、大观霉素、强力霉素、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、多粘菌素、氟苯尼考8种药物耐药率在5.5%～35.5%之间。由表3可知,分离的127株致病性沙门呈现多重耐药性,分离的菌株至少耐6种药物,以耐10(13.4%)、9(19.9%)、8(14.2%)种药物的分离菌株最多。

表2 耐药性检测结果(n=127)Table 2 Drug resistance test results(n=127)

表3 多重耐药性分析结果Table 3 Analysis results of multidrug resistance

2.6 耐药基因检测结果

由表4可知,127株致病性沙门氏菌携带不同的耐药基因,其中耐药基因Sul1、Sul2、Sul3、TetA、TetM、TetR、aac(3)-Ⅰv、aac(6')-Ⅰb检出率在32.3%～89.8%之间;耐药基因tem、cmy、shv、gyrA、gyrB、qurS、floR、mcr-1、检出率4.7%～17.3%。由表5可知,β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类4类药物的耐药表型与耐药基因型的符合率为100%,其他类药物的耐药表型与耐药基因型符合率在84.6%～94.4%。

表4 耐药基因检测结果Table 4 Results of drug resistance gene detection

表5 分离菌耐药表型与耐药基因相关性的分析结果Table 5 Correlation analysis between drug resistance phenotype and drug resistance gene of isolates

3 讨 论

沙门氏菌是临床中重要的食源性致病菌之一,该菌广泛存在环境中,通过环境(屠宰、加工厂、零售等)在肉品生产链中进行相互传播,造成猪肉及其制品的污染[8]。猪肉是我国人们肉类食品的重要来源之一,生猪的屠宰是生猪养殖和猪肉品加工过程中必不可少主要的中间环节,对生猪屠宰加工及零售环节中病原微生物的安全监管是保证猪肉及制品品质量安全重要防线,对保障猪肉及制品具有重要的意义[9]。相关研究表明,国内外关于食品沙门氏菌污染的食物引起人们食物中毒事件越来越多,食物中毒以使用受污染的肉类(猪肉和鸡肉)和蛋制品为常见[10]。因此,对生猪屠宰加工及零售环节中进行沙门氏菌污染监测具有重要的意义。本研究从采集的357份病料样品中分离到191株沙门氏菌,分离率为51.1%,其中127株为能引起小鼠死亡为致病性沙门菌,说明该地区猪屠宰加工及零售环节中沙门氏菌污染严重,应该引起重视,加强屠宰加工及零售环节中安全监管,减少沙门氏菌对猪肉的污染。

沙门氏菌是具有多种致病性的血清型,且具有地区差异性,不同地区的沙门氏菌血清型流行不同,许多血清型可以感染人,其中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌是感染人沙门氏菌主要的血清类型[11]。本研究表明,127株沙门菌中有13种血清型,其中以猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伦敦沙门氏菌为流行优势血清型。说明该地区猪肉食品加工、销售环节中沙门氏菌血清型呈现多样化流行。本次检测的鼠伤寒沙门氏菌占的比例较大,可能对人们存在潜在的威胁,引起注意。与贺恒旭等[9]、黄邵军等[8]报道猪肉屠宰加工及零售环节中存在有差异性,可能与地区与猪肉屠宰加工生产中管理有关。

随着临床中不同种类的抗生素在养猪生产过程中的广泛应用,导致出现较强的耐药性,其耐药性越来越严重,从而导致猪肉及制品中药物残留问题和细菌耐药问题愈发严重,沙门氏菌的耐药性问题已经很普遍[12]。国内许多相关研究表明,猪、鸡肉及制品屠宰加工及零售环节中分离的沙门氏菌产生严重的耐药性[13]。本研究中,127株沙门氏菌对阿莫西林、氨苄西林、磺胺二甲氧嘧啶等8种药物耐药率在56.7%以上,分离的菌株至少耐6种药物,呈现多重耐药性,说明该地区猪肉食品屠宰加工及销售环节中沙门氏菌耐药性严重。与靳浩展[14]、贺恒旭等[9]、黄邵军等[8]报道一致。耐药基因是一种对抗生素有抵抗作用的蛋白质物质,细菌耐药性产生与携带的耐药基因具有相关性,耐药基因可通过多种途径(质粒、转座子、整合子)菌株、环境、食物、动物及人之间传播,不仅导致其耐药性产生还威胁人们健康[3-4]。本试验研究表明,127株沙门氏菌携带多种耐药基因,经分析127株沙门氏菌的耐药表型与耐药基因之间基本呈正相关,其符合率在84.6%～100%之间。可能分离菌株所产生的的耐药性携带耐药基因相关,其作用机制有待进一步研究。

4 结 论

本研究表明,2021-2022年承德地区猪屠宰场加工厂及零售374份样品中致病性沙门氏菌株127株,能引起小鼠死亡;致病性沙门氏菌具有多种血清型,呈现多重耐药,携带多种耐药基因。