25-羟基维生素D3对肉鸡生长性能、骨骼发育及小肠磷转运蛋白基因表达的影响

何 蕾,段延民,张 宁,齐雯露,贺明星,曹金党,韩进诚*

(1. 河南师范大学 生命科学学院,河南 新乡 453000;2. 商丘师范学院 生物与食品学院,河南 商丘 476000;3. 河南省绿色功能饲料添加剂开发与应用工程技术研究中心,河南 商丘 476000;4. 陕西省现代农业科学研究院,陕西 西安 710018;5. 河南农业大学 动物科技学院,河南 郑州450046;6. 河南正本清源科技发展股份有限公司,河南 商丘 476000;7.山东海能生物工程有限公司,山东 日照 276800)

维生素D作为一种脂溶性维生素,能够在动物体内被转化为高活性的1, 25-二羟维生素D3(25-OH-D3)从而调节动物体内钙磷代谢。25-OH-D3作为一种新型的维生素D产品,与VD3相比较,具有更高的生物学活性[1]。瞿红侠等[2]研究表明以生长性能和骨骼矿化指标评价,在1～42日龄肉鸡日粮中,25-OH-D3生物学效价约为维生素D3的1.81倍。与VD3一样,25-OH-D3也可以提高家禽磷的利用率,降低磷排泄对环境的污染[3]。Han等[4]研究表明25-OH-D3在促进肉鸡生长性能和骨骼矿化方面的活性约为维生素D3的2.03倍。

研究发现,25-OH-D3可改善肉鸡生长性能和骨骼发育,提升健康状况。梁彦明等[5-6]在饮水中添加25-OH-D3发现可增加肉鸡体增重及采食量,显著降低料重比。张金龙等[7]发现饲粮中添加500 IU/kg 25-OH-D3可有效改善肉鸡生长性能及骨骼质量。Parkinson和Cransberg[8]研究显示,25-OH-D3能降低佝偻病的发病率,改善肉鸡软骨病,增强骨骼硬度。Vazquez等[9]研究表明,饲喂适量添加25-OH-D3的饲粮对肉鸡免疫力有积极的影响,提升了肉鸡的抗病能力。

由以上研究可知,25-OH-D3可有效提高家禽的生长性能、骨骼质量及机体磷含量,但目前国内关于25-OH-D3调控肉鸡十二指肠磷转运蛋白的研究较少。本文旨在探究饲粮中添加一定量25-OH-D3对十二指肠相关磷转运蛋白基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.25%的25-OH-D3预混剂购自山东海能生物工程有限公司,25-OH-D3活性为5.0×105IU/g。

1.2 试验动物与试验设计

选用140只1日龄体重均匀且正常的罗斯308肉鸡,随机分为2个处理组,每处理组5个重复,每个重复14只。共设计2种饲粮,分别在基础饲粮中添加0、2000 IU/kg 2种水平的25-OH-D3,饲喂粉状饲料,自由采食,饮水充足,试验期14 d。

1.3 试验饲粮

试验根据NRC(1994)配制玉米-豆粕型饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表1。试验饲粮在基础饲粮(钙1.00%、非植酸磷 0.45%、无额外添加维生素D)中分别添加0、2000 IU/kg的25-OH-D3。

表1 基础饲粮的组成和营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet (air dry basis)

1.4 生长性能的测定

饲喂试验期间每天记录肉鸡采食量、死亡鸡只重量,扣除死亡鸡只的采食量,并在第14日龄对已空腹12 h的肉鸡称重。统计肉鸡采食量和平均日增重,计算饲料转换率。

1.5 屠宰试验及样品收集

饲喂试验结束后,14日龄时,每重复选择2只体重相近且已空腹12 h的肉鸡称重后屠宰并取样。取样之前,先将手术剪刀、镊子等解剖器械清洗干净,用高压灭菌锅灭菌后烘干待用。每只肉鸡剪取十二指肠(中间1/2处),用灭菌后的载玻片刮取十二指肠黏膜3份,置于去除RNase的1.5 mL离心管中,标记编号,液氮预冷,放入-80 ℃超低温冰箱冷冻保存。同时剥离肉鸡胫骨,去除大部分肌肉,放入自封袋中,-20 ℃冷冻保存。

1.6 骨骼指标的测定

将左侧的胫骨放入沸水中煮3～5 min,剥去多余肌肉软骨,放入105 ℃烘箱中烘30 h。胫骨烘干后测量相关指标。胫骨重量用分析天平称量,胫骨长度和胫骨直径由游标卡尺测量。测量后将胫骨压碎,放入坩埚,放入600 ℃的马弗炉中灰化36 h,灰化后分别用EDTA滴定法和钼黄比色法测定胫骨钙、磷含量。

1.7 肠道总RNA的提取、反转录和PCR扩增

1.7.1 引物设计 选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因,用Primer 5.0软件设计引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列见表2。

表2 PCR引物序列及参数Table 2 PCR Primer sequences and parameters

1.7.2 RNA提取和cDNA检测 将保存于-80 ℃冰箱的样品取出,通过Trizol法提取样品总RNA。使用超微量核酸蛋白测定仪检测RNA浓度及质量,质量较好的RNA的OD值(OD260/OD280)介于1.8～2.0之间。用反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)以提取的RNA为模板反转录合成cDNA,使用超微量核酸蛋白测定仪检测cDNA浓度,再将cDNA配置为所需浓度并按所需量分装,置于-80 ℃冰箱保存。

1.7.3 荧光定量PCR 将保存于-80 ℃冰箱的cDNA取出置4 ℃冰箱中融化,用SYBR Green I荧光法以cDNA为模板进行PCR反应。以GAPDH为内参基因,用相对定量2-ΔΔCt法计算十二指肠磷转运蛋白(mVDR、nVDR和NaPi-IIb)基因表达量。

1.8 统计分析

试验数据用Excel 2010整理,再用SAS 9.0统计软件以每重复为单位,对得到的试验数据用Tukey法进行多重比较分析,P<0.05作为判断差异显著性的标准。得到的数据以“平均值±标准差”表示,使用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 25-OH-D3对肉鸡生长性能的影响

由表3可知,饲粮中添加2 000 IU/kg 25-OH-D3显著增加了1～14日龄罗斯308肉鸡体增重,与基础饲粮组相比提高53%(P<0.05);饲粮中添加2 000 IU/kg 25-OH-D3显著增加了1～14日龄罗斯308肉鸡采食量,与基础饲粮组相比提高26%(P<0.05);饲粮中添加2 000 IU/kg 25-OH-D3显著降低了1～14日龄罗斯308肉鸡料重比,与基础饲粮组相比降低了18%(P<0.05)。

表3 25-OH-D3对肉鸡生长性能的影响Table 3 Effect of 25-OH-D3 on growth performance of broilers

2.2 25-OH-D3对肉鸡骨骼发育的影响

由表4可知,饲粮中添加25-OH-D3显著提高1～14日龄肉鸡胫骨重量、长度、灰分重量、灰分含量、钙含量和磷含量。与基础饲粮组相比,添加2 000 IU/kg 25-OH-D3后,胫骨重量提高56%,长度提高14%,灰分重量提高102%,灰分含量提高33%,钙含量提高28%,磷含量提高24%(P<0.05),但对肉鸡胫骨直径无明显影响(P>0.05)。由此可知,饲粮添加2 000 IU/kg 25-OH-D3可显著改善1～14日龄罗斯308肉鸡胫骨质量(P<0.05)。

表4 25-OH-D3对肉鸡胫骨发育的影响Table 4 Effect of 25-OH-D3 on tibia development of broilers from 1 to 14 days of age

2.3 25-OH-D3对肉鸡十二指肠磷转运蛋白基因表达的影响

由图1～3可知,与基础饲粮组相比,添加2 000 IU/kg 25-OH-D3后,nVDR mRNA表达量提高111%,mVDR mRNA表达量提高109%,NaPi-IIbmRNA表达量提高146%。由此可知,添加2000 IU/kg 25-OH-D3显著增加1～14日龄肉鸡十二指肠磷转运相关蛋白nVDR、mVDR和NaPi-IIb mRNA表达量(P<0.05)。

图1 25-OH-D3对nVDR mRNA表达的影响Fig.1 Effects of 25-OH-D3 on nVDR mRNA expression

图2 25-OH-D3对mVDR mRNA表达的影响Fig.2 Effects of 25-OH-D3 on mVDR mRNA expression

图3 25-OH-D3对NaPi-IIb mRNA表达的影响Fig.3 Effects of 25-OH-D3 on NaPi-IIb mRNA expression

3 讨 论

3.1 25-OH-D3对肉鸡生长性能的影响

本试验中,饲粮中添加2000 IU/kg 25-OH-D3显著增加了1～14日龄肉鸡体增重、采食量,降低了料重比。叶慧等[10]研究发现,饲粮中添加25-OH-D3能够有效代替维生素D3,25-OH-D3对黄羽肉鸡生长性能有一定的改善趋势。张金龙[7]、陈冠华等[11]研究发现饲粮添加25-OH-D3可提高肉鸡体增重、采食量,降低料重比,改善肉鸡生长性能。

3.2 25-OH-D3对肉鸡胫骨发育的影响

本试验中,饲粮中添加2000 IU/kg 25-OH-D3显著增加1～14日龄肉鸡胫骨的重量、长度、灰分重量、灰分含量、钙含量和磷含量。张霞等[12]研究发现,3 200 IU/kg的25-OH-D3提高了42日龄蛋雏鸡胫骨磷含量。邱凌云[13]研究发现,饲粮添加25-OH-D3能够增加骨骼形态、骨骼强度,增强骨吸收作用。杨德智等[14]研究发现,添加2 760 IU/kg 25-OH-D3可提高胫骨灰分含量,改善骨骼质量。叶慧[10]、陈冠华[11]也得出了相似的研究结果。

3.3 25-OH-D3对肉鸡十二指肠磷转运相关基因表达的影响

本试验结果表明,饲粮中添加2000 IU/kg 25-OH-D3可显著提高1～14日龄肉鸡十二指肠nVDR、mVDR和NaPi-IIb mRNA表达量。刘亚楠等[15]研究表明,维生素D3与鸭油甘油二酯协同作用可显著上调肥胖大鼠的肝脏nVDR基因表达量。汪智云[16]研究发现,添加800 IU/kg 25-OH-D3显著提高蛋鸡十二指肠CaBP-D28k、nVDR表达量。

4 结 论

饲粮中添加2000 IU/kg 25-OH-D3显著改善1～14日龄罗斯308肉鸡的生长性能,改善骨骼质量,促进骨骼发育,且能够上调1～14日龄肉鸡十二指肠磷转运蛋白nVDR、mVDR和NaPi-IIb 的mRNA的表达水平。