谷维素含量测定方法的研究

邓 洪，吴小桥，雷果平，张 福，岳玉华

(1 南充市食品药品检验所，四川 南充 637100；2 川北医学院药学院，四川 南充 637100)

谷维素(Oryzanol)是米糠油的重要生物活性植物化学成分，具有较强抗氧化及清除自由基能力[1]。在最近的大量实验研究中，发现谷维素具有较多的药理作用，如抗氧化、减轻胰岛素抵抗、改善不愉快的更年期症状、抗炎[2-3]。由于它具有许多有益于人类健康的生理作用而引起了全球的关注，其主要用于更年期综合征的镇静助眠、调节经前期紧张等多种情况[4]。

中华人民共和国卫生部颁发的药品标准(简称部颁标准)对谷维素含量测定的方法是采用正庚烷为溶媒，在水浴中震荡使谷维素溶解，照紫外分光光度法(UV)，在(315±1)nm的波长处测定吸光度，计算含量[5]。然而，该方法使用正庚烷作为溶剂，其具有大的膨胀系数，容易导致测定结果稳定性差。根据谷维素的理化性质特点，本文优化了现有高效液相色谱法的色谱条件，结果表明在该色谱条件下测定谷维素的含量更准确可靠、灵敏度高。

1 实 验

1.1 仪 器

Agilent1260-VWD型液相色谱仪；KQ-800DE型数控超声波清洗器；CP225D型电子天平。

1.2 试 剂

甲醇(色谱纯)；对照品为美国Stanford Analytical Chemical Inc.生产(批号为ML201212-02、纯度为99.53%)；供试品谷维素来自A公司(批号为20102103)、B公司(批号为210508 /003、201218 /001)、B公司(批号为20211110)、C公司(批号为210309)，规格均为10 mg。

2 实 验

2.1 色谱条件

色谱柱：APS-2 HYPERSIL NH2色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇(色谱纯)；进样量：20 μL；检测波长：323 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL· min- 1。理论塔板数按谷维素峰计算不低于8 000。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液配制

精密称定谷维素对照品0.010 78 g，置100 mL容量瓶中，加入适量甲醇，经超声处理15 min使其溶解，冷却，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液配制

精密称定约相当于谷维素0.01 g的供试品，置100 mL容量瓶中，加入适量甲醇，经超声15 min使谷维素溶解，冷却，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3 方法学考察与结果

3.1 专属性试验

精密量取谷维素对照品溶液，在上述色谱条件下检测，记录色谱图。同时记录空白对照的色谱图。色谱图表明该方法专属性良好。

图1 谷维素对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of oryzanol

图2 谷维素空白对照色谱图Fig.2 Blank control chromatogram of oryzanol

3.2 线性关系

精密量取上述对照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、25.0 mL，分别加入到25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列对照品溶液。精密量取制备好的对照品溶液各20 μL，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。标准曲线以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，计算线性回归方程。线性方程为：Y=38.372x-24.404，R2=0.999 9，其结果表明谷维素的浓度在3.97～99.28 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

3.3 稳定性试验

取“3.2.2”项下配制好的供试品溶液，分别在0 h、4 h、16 h、40 h进样测定，记录峰面积，计算供试品的平均含量和RSD。计算得四个谷维素样品RSD分别为0.1%、0.1%、0.2%、0.2%，数据结果表明样品在40 h内基本稳定。

3.4 重复性试验

取批号20211110的谷维素供试品，按照上述供试品溶液制备方法配制，在上述色谱条件下进样测定6次，计算含量。经计算得供试品平均含量和RSD分别为96.0%和0.2%，表明该方法重复性良好。

3.5 回收率试验

表1 回收率试验Table 1 Recovery test

续表1

称取批号为201218/001供试品如表2所示，加入精密称取的对照品适量(约相当于处方量的80%、100%、120%)，按上述制备方法制备低、中、高浓度的溶液各3份，进样测定，记录色谱图，计算样品回收率。三者的平均回收率分别为99.97%、101.22%、100.4%，RSD分别为0.5%、0.3%、0.4%。

3.6 样品含量测定

4 讨 论

4.1 测定方法的选择

由于各个医药生产公司生产的谷维素片有所差别，所以对其质量要求需有较严格的规定。在以往的研究成果中，谷维素的含量测定方法有通过构建定量分析模型的近红外漫反射光谱法[6]、改变溶剂的紫外分光光度法(UV)[7-8]，其流程都较为繁杂琐碎。其中由于谷维素样品中存在除阿魏酸酯之外的其他紫外吸收基团，使用UV法测定会使检验的结果偏高。薄层色谱法(TLC)也可测定谷维素的含量[9]，但其缺乏一定的准确性，处理时间也相对较长。本文针对谷维素的物理化学特性及不同方法的比较筛选，最终决定采用高效液相色谱法进行谷维素含量的测定，结果可靠，重复性好，可为进一步分析谷维素的成分和药效关系提供依据。

4.2 溶剂的选择

谷维素在水中不溶，在甲醇、氯仿、丙酮和苯等有机溶剂中溶解。本研究采用甲醇超声提取供试品，可消除部颁标准中正庚烷作为溶剂膨胀系数大的问题。在实验过程中发现超声提取比水浴提取节约时间、溶解充分，且在使用超声提取法的情况下测定所得的结果误差较小，试验中也没有出现粘壁结块的现象。在试验过程中，要确保所用的容器干燥无水，如果所用容器中含有水分，会把样品粉末覆盖，从而形成一层保护层，阻止样品中的谷维素溶解，即使延长超声时间，同样会导致测定结果有误差[10]。试验中对乙腈和不同比例的甲醇-水溶液进行了探索，结果表明100%甲醇溶液的溶解效果较好。使用乙腈作为溶剂，其与甲醇作溶剂所得峰无显著性差异。出于经济因素考虑，本试验最终选用了以甲醇为溶剂。

4.3 色谱条件的优化

图3 谷维素双峰现象Fig.3 Double peak phenomenon of oryzanol

传统的高效液相色谱法大多使用C18柱为分析柱，在出峰时间、柱子污染情况等方面会对谷维素的分析造成了一定的影响。同时，谷维素来源于天然产物，是一种阿魏酸酯类混合物，采用C18柱法进行分析，很容易从中分离出多个组分，难以得到标准的样品[11]。在本次试验探索过程中曾使用过C18柱作为分析柱，但其色谱图中出现双峰现象，如图3所示。因此，经过多方面考虑决定采用NH2柱，可以有效地解决或避免使用C18柱时出现的上述问题。在一些高效液相色谱方法中，含氯仿的混合溶剂常被广泛用作流动相，但较担心其使用对人体和环境的安全性。故本研究通过对HPLC法进行改进，经比较乙腈、不同比例的甲醇-水、甲醇溶液，最终建立了一种简单、准确的测定方法，采用甲醇这种非氯化溶剂作为流动相。试验过程中探究了不同柱温、流速、波长等色谱条件，最终选用了柱温为30 ℃、流速为1.0 mL· min-1、检测波长为323 nm、进样量为20 μL的色谱条件。通过对色谱条件的优选和一系列方法学考察，结果表明所用的方法符合标准，为谷维素制剂品质控制和质量检测提供了更好的依据。但目前该方法还存在着不足之处，如采用甲醇(色谱纯)作为流动相出峰较早，不利于后续进行有关物质分析。

5 结 论

实验结果表明在优化的色谱条件下实验数据表明谷维素浓度在3.97～99.28 μg/mL范围内线性关系良好(R2为0.999 9)，样品在40 h内基本稳定，重复性良好。采用高效液相色谱法测定谷维素的含量简便快捷、结果准确可靠。