抵当汤调节线粒体自噬对脑出血后神经损伤的保护作用及机制

卢靖 张冬梅 唐晓雷 兰天野 吴子菁 王健

(长春中医药大学附属医院 1中医药研究中心,吉林 长春 130117;2科研办公室;3脑病科;4长春中医药大学中医学院)

脑出血(ICH)是一系列具有高死亡率、高发病率和高复发率的破坏性脑血管疾病。国医大师任继学教授根据“离经之血便是瘀血”的理论,提出破血化瘀法治疗ICH的治疗原则〔1〕。前期研究表明,以抵当汤(DDT)为主的破血化瘀治疗方案可有效改善ICH患者的临床症状,提高患者的日常活动能力〔2〕,但其作用机制尚未明确。线粒体损伤是ICH诱发继发性脑损伤的关键因素〔3〕。线粒体自噬能够消除受损的线粒体蛋白或部分线粒体网络,并通过生物发生添加蛋白质和脂质来更新成分,共同导致线粒体周转,维持线粒体稳态〔4〕。本研究从线粒体自噬的角度考察DDT对ICH大鼠和氯化钴(CoCl2)诱导PC12细胞损伤模型的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1动物及药品 成年雄性SD大鼠(体质量250～300 g)购于长春亿斯公司。DDT方药购买于长春中医药大学附属医院,由长春中医药大学附属医院实验中心中药制剂室制备。将中药浸泡于8倍体积的纯水中,大火煮沸转小火煎煮1 h,倒出煎煮液。重复煎煮3次,并将3次煎煮液混合,离心后取上清应用冻干机进行冻干,得到粉末备用。

1.2主要试剂 凋亡试剂盒(556421)购自BD公司;Tunel染色试剂盒(C1088)、线粒体膜电位(MMP)试剂盒(C2006)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(S0087)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(S0058)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(S0131S)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(S0051)购于碧云天生物技术公司;RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购于Gibco公司;Parkin(ab77924)、PTEN诱导激酶(Pink)1(ab186303)、微管相关蛋白轻链(LC)3Ⅱ(ab48394)、P62(ab155686)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(ab8245)抗体购于Abcam公司。

1.3ICH模型建立及分组 动物的手术程序和护理均按照长春中医药大学实验动物伦理委员会的指南进行。将ICH造模组用异氟烷麻醉并放置在立体定位框架中。在前囟右侧3 mm和前囟后0.4 mm钻孔,并通过26号针在5 min内在6.5 mm深度处注入50 μl自体血。假手术(Sham)组操作与ICH造模组一致,但不注入自体血。用骨蜡封住洞口缝合伤口。实验中保持大鼠体温为37 ℃,且醒来后可自由进行摄食和饮水。分组:①神经功能评分和凋亡实验中,将大鼠随机分为Sham组、ICH组、脑血康(NXK组,0.64 mg/100 g,1次/d)、ICH+DDT低剂量(LD组,0.13 g/100 g,1次/d)、ICH+DDT中剂量(MD组,0.26 g/100 g,1次/d)、ICH+DDT高剂量(HD组,0.52 g/100 g,1次/d);②氧化损伤相关生物酶检测实验中,分为Sham组、ICH组、LD组、MD组、HD组;③Western印迹和免疫组化检测自噬相关蛋白表达实验中,分为Sham组、ICH组、LD组、MD组、HD组、线粒体自噬诱导剂CCCP阳性对照(CCCP组,4 mg/kg,1次/d)。

1.4神经功能评分 使用Longa神经学评分评估各组神经损伤严重程度:0级,无神经功能缺损;1级,左前爪不能完全伸展;2级,向左盘旋;3级,向左坠落;4级,不能自主行走。分数越高,伤害越严重。评分由两名人员按照双盲原则进行评估。

1.5PC12细胞培养及分组 PC12细胞系肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株购自ATCC细胞库。PC12培养基RPMI1640中加入5%胎牛血清、10%马血清1%双抗。在进行实验前,预先应用50 ng/ml神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞48 h,使其分化为神经性细胞。150 μmol/L的CoCl2诱导PC12细胞24 h作为造模条件。分组:①细胞凋亡实验中将细胞分为空白组、CoCl2组、CoCl2+DDT低剂量组(50 μg/ml)、CoCl2+DDT中剂量组(100 μg/ml)、CoCl2+DDT高剂量组(200 μg/ml)、CoCl2+NXK组(50 μg/ml);②MMP实验中将细胞分为空白组、CoCl2组、CoCl2+DDT低、中、高剂量组。

1.6膜联蛋白Ⅴ异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ)/碘化丙啶(PI)染色 根据制造商的说明,使用Annexin Ⅴ/PI染色分析细胞凋亡。消化的PC12细胞,1 500 r/min离心5 min收集细胞。去除上清液后,将细胞重悬于50 μl结合缓冲液,在缓冲液中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC染料避光孵育15 min,然后加入5 μl PI室温避光5 min。加入400 μl结合缓冲液后,使用流式细胞仪分析每10 000个细胞中凋亡细胞的百分比。

1.7MMP检测 根据制造商的说明书,通过JC-1 荧光探针测量MMP。细胞在6孔板(1×105个/孔)中培养,用不同浓度DDT处理48 h。将细胞用JC-1探针在37 ℃避光染色30 min,并在荧光显微镜下观察分析。

1.8氧化应激关键因子检测 将各组细胞用RIPA缓冲液裂解。根据制造商的说明,通过试剂盒测定SOD、CAT活性及GSH-Px、MDA含量。

1.9Western印迹检测 在冰上将细胞或脑组织在RIPA缓冲液裂解30 min,并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度并在100 ℃下煮沸5 min后制备热休克蛋白。待测样品蛋白(50 μg)经过12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脱脂牛奶常温封闭1 h后,4 ℃孵育一抗(Parkin、Pink1、LC3Ⅱ、P62)过夜。在室温下与抗体同源二抗孵育1 h后,GAPDH用作对照内参,使用化学发光成像系统观察和分析蛋白质条带。

1.10Tunel染色检测脑组织神经细胞凋亡 应用4%多聚甲醛固定脑组织,分别进行石蜡包埋和切片后,根据试剂盒说明进行Tunel染色。在5个随机选择的显微镜视野中以放大200倍进行拍照。

1.11免疫组化检测 取经脱蜡-抗体复原的脑组织切片进行免疫组织化学染色。应用5%脱脂奶粉在室温下孵育20 min封闭,分别加入LC3Ⅱ(1∶100)、P62(1∶100)一抗4 ℃孵育过夜。次日应用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后滴加二抗,37 ℃孵育30 min,加入二氨基联苯胺(DAB)显色液5 min,蒸馏水清洗后在苏木素中复染2 min,脱水后拍照。

1.12统计学分析 采用GraphPad Prism6软件进行非配对t检验或one-way ANOVA分析。

2 结 果

2.1DDT对ICH神经功能评分的影响 与Sham组比较,ICH组左侧肢体活动不利,呈明显的偏瘫状态,且以前肢为重,在行走过程中会表现出逆时针旋转的追尾行为。与ICH组比较,DDT各剂量组和NXK组在给药第1天和第3天后,行为学症状明显改善,在第7天时症状基本消失(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。见表1。

表1 各组不同时间神经功能缺损评分比较(分,

2.2DDT对ICH病灶组织氧化损伤的影响 与Sham组比较,ICH组SOD、CAT、GSH-px水平明显降低,MDA水平明显升高(P<0.01,P<0.001)。与ICH组比较,LD、MD及HD组SOD、GSH-px水平明显升高,MDA水平明显降低(P<0.05,P<0.01);MD及HD组CAT水平明显升高(P<0.05)。由此证明,DDT对ICH病灶组织的氧化损伤具有保护作用。见表2。

表2 各组脑组织氧化损伤相关生物酶变化

2.3DDT对ICH病灶组织细胞凋亡的影响 ICH组绿色荧光表达明显增高,表明ICH组凋亡细胞显著增加;与ICH组比较,NXK组及LD、MD、HD组绿色荧光表达降低,表明DDT能抑制ICH病灶组织细胞凋亡,并且HD组与NXK组抑制作用相当,说明其对脑组织神经细胞凋亡的影响呈浓度正相关。见图1。

2.4DDT对COCl2诱导的PC12细胞凋亡和MMP的影响 流式细胞术结果表明,与空白组〔(10.40±0.58)%〕比较,CoCl2组细胞凋亡率〔(30.77±1.22)%〕显著升高(P<0.001)。与CoCl2组比较,CoCl2+NXK组细胞凋亡率〔(22.52±2.45)%〕显著降低(P<0.01);CoCl2+DDT不同剂量组细胞凋亡率〔(22.92±2.31)%、(21.50±2.31)%、(17.45±0.85)%〕显著降低(P<0.01,P<0.001),且呈剂量依赖性。应用JC-1荧光探针检测MMP变化,与空白组比较,CoCl2组绿光显著增强,红光显著降低,说明MMP明显降低,DDT治疗后绿光显著降低,红光显著增强,说明DDT能够恢复CoCl2对PC12细胞MMP的损伤作用。由此说明,DDT能够降低细胞凋亡,并对神经细胞线粒体功能具有恢复作用。见图2、图3。

图1 Tunel染色检测各组病灶组织细胞凋亡(×200)

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡

图3 JC-1探针荧光检测各组MMP(×200)

2.5DDT对ICH病灶组织线粒体自噬相关蛋白表达的影响 Western印迹显示,与Sham组比较,ICH组LC3Ⅱ蛋白表达显著增加,P62表达显著下降(P<0.05),这可能是由于线粒体自噬在ICH发生后机体启动反应以清除受损细胞的一个保护机制作用(P<0.001)。与ICH组比较,LD组显著增加Pink1和LC3Ⅱ表达;MD组显著增加LC3Ⅱ表达;HD组显著增加Parkin、Pink1和LC3Ⅱ表达,显著抑制P62表达(P<0.05,P<0.01)。与ICH组比较,CCCP能明显促进线粒体自噬相关蛋白Pink1、LC3Ⅱ表达,明显抑制P62表达(P<0.05,P<0.01),发挥激活线粒体自噬的作用。见图4、表3。

表3 各组病灶组织自噬相关蛋白表达比较

1～6:Sham组、ICH组、LD组、MD组、HD组、CCCP组图4 Western印迹检测各组病灶组织自噬相关蛋白表达

2.6免疫组化法检测DDT对ICH病灶组织LC3Ⅱ和P62蛋白表达的影响 免疫组化结果表明,DDT能够促进LC3Ⅱ蛋白表达,抑制P62蛋白表达,其作用趋势与线粒体自噬激活剂CCCP一致,说明DDT干预ICH疾病过程与线粒体自噬机制相关。见图5。

图5 免疫组化法检测各组病灶组织LC3Ⅱ和P62蛋白表达(×200)

3 讨 论

破血化瘀法治疗ICH的治疗策略,即应用重剂活血药使瘀血得以破除,其主要应用《伤寒论》中的DDT,并且经过反复临床实践,证实本法安全可靠〔1〕。多项临床研究表明〔2,5〕,破血化瘀法能促进血肿吸收及改善神经功能缺损,可降低ICH急性期病死率,提高日常生活能力,降低致残程度,使破血化瘀法治疗ICH方案得到推广应用,这其中应用最广的即为DDT。本实验发现,DDT能够明显抑制细胞凋亡,对MMP具有明显的恢复作用,同时还能够抑制ICH大鼠血肿周围细胞的氧化酶活性,促进抗氧化酶活性。

线粒体在ICH后的早期脑损伤期间发挥了关键作用,通过急性脑缺血导致活性氧(ROS)过量产生〔6〕。证据表明,自噬发生在ICH诱导的早期脑损伤中〔7〕。本研究证明,神经细胞在ICH疾病过程中受到严重损伤且神经细胞的凋亡与线粒体受损存在紧密联系。由于ROS在自噬中起重要作用,受损的线粒体可产生超过抗氧化系统能力的ROS,引起线粒体蛋白、脂质和mtDNA的氧化修饰,导致线粒体功能障碍〔8〕。因此,通过检测几种维持氧化还原平衡中发挥关键作用的酶,本实验结果说明,ICH后血肿周围脑组织发生氧化还原失衡。ROS水平升高会直接激活自噬反应,在自噬刺激下,LC3-I转化为磷脂酰乙醇胺结合的LC3Ⅱ形式〔9〕。与本实验结果一致,并且利用DDT进行干预后,能进一步促进LC3Ⅱ表达,证明ICH损伤后神经元存在自噬反应。

受损和多余的线粒体被选择性降解以维持线粒体稳态〔10〕。其中研究较多的途径之一是Pink1/Parkin途径〔11〕。已知线粒体损伤会引的线粒体膜电位降低,随后导致Pink1在线粒体外膜上表达,Pink1表达稳定时,Pink-Parkin依赖性线粒体自噬反应被激活〔12～14〕。Pink1磷酸化激活Parkin,使线粒体蛋白多泛素化,导致其与自噬受体的泛素结合域结合并形成自噬体。然后自噬体与溶酶体融合,导致线粒体降解〔15～17〕。本实验结果证明,DDT具有促进自噬的作用,且DDT能促进线粒体自噬关键蛋白Parkin和Pink1表达,证明DDT是通过调控线粒体自噬发挥保护神经细胞的作用。