桔小实蝇试验种群饲养技术研究

尹伊秀娟，胡永华，李裕展，杨洁，詹儒林，吴正伟

（1.云南农业大学热带作物学院，云南 普洱 665099；2.中国热带农业科学院湛江试验站，广东 湛江 524013；3.中国热带农业科学院三亚研究院，海南 三亚 572024；4.广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088）

桔小实蝇（Bactrocera dorsalisHendel），属双翅目（Diptera），实蝇科（Trypetidae），果实蝇属（Bactrocera）[1]。桔小实蝇广泛分布于华南、西南等9 省区，其寄主范围广，可危害番石榴、芒果、杨桃等百余种水果和蔬菜[2]。其危害方式主要是雌虫产卵于寄主果实内，孵化后的幼虫蛀食果肉造成果实腐烂，未熟先落果，严重影响果实产量[3]。研究发现，桔小实蝇在我国华南地区全年发生[4]，华东地区还存在越冬现象[5]，桔小实蝇种群受气温、降雨、食物等因素影响较大[6]，虫口数不稳定。近年来，随着国内外学者对桔小实蝇在生物学、生理学、病理学，以及遗传学等领域研究的不断深入[7-9]，实验室需要大量龄期一致的桔小实蝇作为试验材料。因此，探索桔小实蝇实验室种群饲养方法，规范饲养流程成为桔小实蝇各项生物学研究的基础。

关于桔小实蝇的饲养早有报道。陈毅超等[10]研究表明，酵母和蔗糖是饲料配方不可或缺的主剂，比例不超过25%，氨基酸可分为差异显著的4 个数量级，B 族维生素和矿物质分为3 个数量级，并推断桔小实蝇对氨基酸种类的需求大于含量，B 族维生素则刚好相反。袁盛勇等[11]测定桔小实蝇单雌产卵量和孵化率，筛选出最理想饲料配方（酵母粉20 g、大豆蛋白5 g、糖60 g、琼脂6 g、尼白金0.6 g、山梨酸0.4 g、抗坏血酸3 g、鸡蛋25 g、水500 mL）。袁盛勇等[12]通过人工饲喂和建立试验室种群，分别统计25 ℃、28 ℃条件下，桔小实蝇的孵化率与羽化率，结果差异不大，证明在试验室内饲养方法可行。郑传伟[13]自主研发了新型实蝇多虫态饲养箱，与传统养虫箱比，新型实蝇多虫态饲养箱的孵化率、化蛹率、羽化率均差异显著。郑传伟[14]在冬季饲养桔小实蝇时，通过补充规律光照、控制温度、调整饲喂的管理方法，保障了冬季试验种群的数量以及冬季试验材料的供给。郑小萍等[15]研究表明，幼虫的取食经历对成虫产卵时选择水果的部位和颜色也有影响。袁瑞玲等[16]利用自行设计的新型实蝇多虫态养虫箱和改进的饲料配方饲养桔小实蝇，与传统养虫箱饲养的桔小实蝇相比，其孵化率、化蛹率和羽化率均较高，各阶段发育历期正常及各指标良好，能保证桔小实蝇全年饲养，并获得发育健康的试验材料，但是都没有形成固定流程和规模化饲养技术，因此本研究试图探索桔小实蝇试验室种群饲养方法，规范饲养流程。

根据近年来国内外报道的常用昆虫饲养配方以及桔小实蝇不同虫期饲料及饲养方法[6,14,16]，本研究优化了桔小实蝇饲养笼空间结构、产卵引诱器、幼虫饲养装置、幼虫和成虫饲料、饲养环境调控，旨在探索在保证桔小实蝇健康的前提下，使用简单易操作、成本相对低廉、可重复的饲养方法，为其生物学试验提供数量大、发育整齐、生理状况稳定的桔小实蝇，为桔小实蝇生物学研究提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 养虫笼

本试验所用的网纱式养虫笼为120 目，孔径为0.125 mm（SYL-30B，杭州艾普仪器设备有限公司）。养虫笼要循环通风、高透光、方便观察。正面有拉链式开关门以及袖筒，方便拿取笼内昆虫、更换饲料，同时避免昆虫飞逃，支架方便安装，容易拆卸清洗，结构稳定不易倒。不同大小的养虫笼（30 cm×30 cm×30 cm，40 cm×40 cm×40 cm，50 cm×50 cm×50 cm）适用于不同时期、不同数量的桔小实蝇饲养。

1.2 养虫室

稳定的生活环境对保持桔小实蝇种群稳定非常重要。本研究选择采光充足、通风良好的实验室，配有人工光源，调节光周期，提高桔小实蝇的交配效率，室内还放置养虫笼的桌子或架子。初步探索出光周期（L∶D=14∶10）对雌性桔小实蝇产卵效果最佳，温度为25～28 ℃的条件更适合桔小实蝇的生长发育。养虫室还应避免外界生物的干扰，室内窗户应安装纱窗，避免其他昆虫进入，一旦发现应及时清理。

1.3 野生虫源的采集

从中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃内采集被桔小实蝇寄生的番石榴和杨桃。采集的虫果放置于装有消毒的湿润沙或土（约5cm 厚）的保鲜盒中，让老熟的幼虫跳出化蛹（沙土的湿度保持在75%左右，即用手捏无水滴渗出，成团松开后能分散落下为宜）。羽化后的成虫要隔离饲养，相近日龄的雌雄成虫可共同饲养，增加交配率。养虫笼要根据虫数选择适宜的大小，成虫生活环境过于拥挤会增加死亡率，影响实验室种群建立。

1.4 数据分析

本试验数据使用Microsoft Excel 2010 软件整理数据，使用SPSS 26.0 进行统计分析，采用独立样本t检验分析桔小实蝇净生殖率、平均世代周期、内禀增长率、周限增长率、种群加倍时间在不同饲养模式间的差异显著性，采用邓肯氏新复极差法进行多重比较。生命表各项参数采用文献[17]的计算方法：

式中，x为天数；lx为昆虫个体在x期间的存活率；mx为x期间每头雌蝇的平均产卵量。

2 结果与分析

2.1 卵的采集与孵化

试验采用自制简易集卵器收集桔小实蝇卵（图1、图2）。使用较软的透明塑料杯，深度为8 cm，在距离杯底3 cm 以上部分沿杯壁均匀扎孔，孔直径为1 mm，孔呈反射状，间距1 cm，杯子底部倒入浓缩番石榴汁或放入新鲜的香蕉片，深度为2～3 cm。在桔小实蝇产卵高峰期，于每日上午8：00—9：00 将准备好的集卵器放进桔小实蝇养虫笼中，晚上20：00 取出。用洗瓶将瓶壁上收集到的卵冲洗至纱布上，用移液管将纱布上的卵移至寄主水果中孵化。孵化温度为28℃，湿度为75%。通过人工收集卵，可以繁育出龄期一致的试验种群。

图1 自制集卵器

2.2 幼虫的饲养

幼虫的饲养方式主要有2 种：寄主整果饲养和人工饲料饲养。本着经济、简单、可操作性强的原则，根据饲养的虫数、规模、季节等因素选择饲养方式。

2.2.1 寄主整果饲养 此法一般在饲养虫数较少、温度适宜、有充足寄主水果时使用。用镊子把刚孵化的幼虫直接挑入寄主水果中，使用的寄主水果最好与父母本的寄生水果保持一致（图3、图4）。

图3 幼虫的饲养环境

图4 人工饲料饲养的幼虫

2.2.2 幼虫人工饲养 在不满足上述整果饲养条件时，根据陈毅超[10]方法进行饲养。配方如下：酵母粉5 g、蔗糖10 g、麦麸粉6 g、麦麸12 g、苯甲酸钠0.1 g、对羟基苯甲酸甲醋0.1 g、柠檬酸0.5 g、水60 mL。配制方法：称取对应量的酵母粉、蔗糖和对羟基甲酸甲酯后，加入称量好的水，搅拌均匀后，在70 ℃水浴中煮20 min，同时不断搅拌；待冷却至室温后，依次加入苯甲酸钠、麦麸粉和柠檬酸，并搅拌均匀，最后加入麦麸，搅拌混匀后即可；用保鲜盒（25 cm×17 cm×8 cm）盛装饲料，饲料盒下放铁盘，盘内铺满消毒后湿润的土，深度为5 cm，以便老熟幼虫跳出化蛹。

2.3 蛹

幼虫饲养6～10 d 后，幼虫进入老熟阶段，从食物盒中挑出。蛹孵化床用保鲜盒装沙或土，深度为5 cm，沙或土使用之前要在120 ℃高温下灭菌消毒2 h，待其冷却后再使用，以杀死其他生物。沙过30 目筛，使其颗粒大小合适，便于蛹分离。湿度要求手捏紧时没有水滴下，手放开时沙自然散开为宜（图5）。将孵化床放入网纱式养虫笼内，关上养虫笼门，防止羽化后的成虫后飞走，并保持化蛹场所潮湿且温度适宜，温度为25～28 ℃，相对湿度为70%～80%。羽化后的成虫应及时与蛹分离，分龄饲养，以便为后期试验提供同日龄成虫。

图5 蛹的生活环境

图6 成虫的生活环境

2.4 成虫的饲养

2.4.1 供水器和饲料容器 供水器用直径为125 mm 的培养皿，并在培养皿内侧铺一圈干净的海绵或棉花，给桔小实蝇提供站立的饮水平台，防止其掉入水中淹死。使用干净的水源，适时添水，棉花3～5 d 更换1 次。饲料同样用直径为125 mm 的培养皿盛装。天然饲料饲养1～2 d 更换1 次，人工饲料3～4 d 换1 次，并记录更换时间。每次更换饲料时，清洗培养皿，保持清洁。

2.4.2 成虫饲养（1）天然饲料。直接用寄主水果整果饲养。首先洗干净寄主水果，确保无农药残留，然后放入-20 ℃冰箱冷冻48 h，排除其虫卵或幼虫的影响，最后将水果切片放入培养皿中作为饲料。这种方法的优点是成虫未出现拒食现象，缺点是受季节影响较大，而且水果片易腐烂，更换较为频繁，适用于桔小实蝇成虫数量较少的情况。（2）人工饲料。人工饲料配方：酵母粉20 g、大豆蛋白6 g、蔗糖40 g、琼脂5 g、水500 mL。上述配料加热溶解后，待冷却至室温时加入对羟基苯甲酸甲酯0.5 g、山梨酸0.5 g、抗坏血酸3.3 g。将适量的饲料盛放在直径为125 mm 培养皿中，并放入养虫笼中，剩余的饲料放入4 ℃冰箱内保存备用。使用人工饲料可以避免天然饲料易腐败、受季节影响大等问题（图7）。桔小实蝇整个生活史的饲养流程如图8 所示。

图7 正在取食的成虫

图8 试验室饲养桔小实蝇流程

2.5 桔小实蝇实验室种群数量统计

本研究对桔小实蝇连续饲养6 代，随机挑选寄主果实中的卵3 000 粒，分为3 组（即3 个重复），分别测定孵化率、化蛹率、羽化率（表1）。结果表明，3 000 粒卵最终成功羽化1 808 头，平均孵化率78.2%，平均化蛹率89.7%，平均羽化率为86.0%，说明使用本方法在实验室内饲养桔小实蝇可行。

表1 桔小实蝇试验室种群不同虫态存活率

2.6 构建桔小实蝇实验室种群生命表

种群生命表参数是评价昆虫种群适合度的重要指标。通过构建种群生命表进行参数分析（表2），人工饲料饲养和寄主果实饲养2 种模式下，桔小实蝇的净增殖率R0分别为262.29、278.30、平均世代历期T分别为59.37、53.18，内禀增长率rm分别为0.12、0.13，周限增长率λ 分别为1.02、1.21，种群倍增时间DT分别为8.33、9.21。只有平均世代历期T在人工饲料饲养条件下高于寄主果实饲养条件，其余4 项参数均是寄主果实饲养条件下高于人工饲料饲养条件下，但是差异均不显著（P＜0.05），说明寄主果实和人工饲料对桔小实蝇的饲养效果接近，且均有利于桔小实蝇的种群增长。

表2 不同饲养方式下桔小实蝇的种群生命表参数

3 讨论与结论

3.1 饲养条件探讨

通过上述方法可以建立实验室桔小实蝇稳定生长种群，但要注意饲养过程中环境的变化，温度、湿度、光照是昆虫种群生长发育和繁殖过程中的重要环境因子。外界温度过高也会影响桔小实蝇成虫、幼虫的生长发育。吴佳教[18]研究表明，当平均温度高达33.3 ℃时，蛹则不能正常发育。赵岚岚[19]研究发现，成虫在（42±1）℃条件下，会热休克2～3 h。温度过高，饲料容易腐烂、变质，变质的食物往往会滋生青霉。金沙[20]发现，未交配和已交配的桔小实蝇雌、雄成虫对青霉菌有显著的驱避反应。笔者同样也观察到桔小实蝇驱避取食腐烂和发霉的食物。食物温度过高会使幼虫无法化蛹并死于果内。另外，土壤温度对桔小实蝇化蛹至关重要，桔小实蝇偏好在阴暗、潮湿的沙壤土中化蛹，可以根据气温变化，改变沙土混合比例，调节沙土的湿度，并配合适时喷水。提供给幼虫化蛹的沙土，必须经过120 ℃高温或在-20 ℃冰箱内72 h 以上冰冻，以消灭其他昆虫卵的干扰。研究发现，为保证能得到良好的桔小实蝇种群，应尽可能采集不同的寄主和地区的虫果[12]。本研究在不同时间、不同园区（杨桃、番石榴、芒果、香蕉、石榴等）收集大量幼虫，丰富了种群的遗传多样性，有利于种群的繁衍。在饲养过程中，成虫羽化后10～15 d极易死亡，这段时间要精心饲养和观察。饲养过程中，要保证饲料和水源清洁无污染，尤其杜绝农药污染。夏天温度过高要注意通风和保持湿度，冬天要防止夜间气温突然降低而导致桔小实蝇种群大量死亡。室内良好的自然光源，有利于黄昏时雌雄成虫的交配。

昆虫人工饲料研究是昆虫规模化饲养中的重要基础研究[21-22]，昆虫人工饲料组成必须满足昆虫生长发育和繁殖的基本营养要求，一般昆虫人工饲料应包括碳水化合物、蛋白质和氨基酸、脂类和固醇类、维生素和无机盐。陈毅超[10]的昆虫饲料配方划分为主剂、填充剂、酸度调节剂，以及防腐剂。本研究中的幼虫人工饲料以蔗糖、酵母粉和麦麸作为主剂，提供基本营养。蔗糖是碳水化合物的主要来源，也是主要的能量物质，并且能被桔小实蝇充分利用。酵母作为次要蛋白质的重要来源，保证生长所需蛋白质和维生素（其中B 族维生素是所有昆虫正常生长发育必不可少的营养因子），丰富了饲料中的营养种类，能够满足桔小实蝇生长所需的维生素、矿物质等营养。麦麸和麦麸粉作为填充剂混合使用，不仅为饲料提供了适宜的物理质地和持水性能。柠檬酸调节食物酸碱度，pH 值为4～4.5 能有效抑制真菌、细菌生长。对羟基苯甲酸甲醋作为防腐剂，可延长储存时间。

3.2 桔小实蝇实验室种群探讨

寄主果实饲养条件下，桔小实蝇世代历期较短，净增殖率、内禀增长率和周限增长率较高；而人工饲料饲养条件下，其世代历期较长、净增殖率最低、内禀增长率和周限增长率较低。综合分析，寄主果实饲养条件下，桔小实蝇有较高的种群适合度，但是二者之间差异不显著，说明无论是人工饲料饲养还是寄主果实饲养桔小实蝇均能较好地完成世代正常生长发育。

研究表明，昆虫取食不同的食物对其生长发育表现出一定的差异，从而影响昆虫种群的增长[23]。本研究中，桔小实蝇在2 种饲养模式下，其内禀增长率存在差异，内禀增长率受昆虫发育速率、存活和繁殖影响，桔小实蝇寄主果实饲养下具有较快的发育速度和较强的繁殖能力，因此内禀增长率较高。净增殖率和平均世代周期是昆虫种群增长的重要因素，其受昆虫存活和繁殖的影响，净增殖率预示种群数量发展的趋势。较短的世代周期可使昆虫较好地避免恶劣环境与天敌侵害，从而提高自身的存活率。本研究中，2 种饲养模式的净增殖率均较高，说明2 种饲养模式下其种群数量均呈较快的增长趋势。