刺参早期发育阶段luqin型神经肽分布及表达特征研究❋

李宸仪, 陈慕雁

(海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学), 山东 青岛 266003)

神经肽是一种作用于神经基质的小型蛋白质[1],由神经肽前体蛋白切割而来[2-3],是动物生理过程和行为的重要调节因子,可作为神经递质、神经调质在局部发挥作用,或作为激素系统性地发挥作用[4]。相较于脊椎动物和陆生无脊椎动物,神经肽在海洋无脊椎动物中研究起步较晚,相关研究主要集中在摄食、繁殖、运动、免疫、生长发育等方面[5-8]。

luqin型神经肽最初因其在软体动物海兔(Aplysiacalifornica)腹神经节左上象限的L5神经元(the Left Upper Quadrant cells of the abdominal ganglion)中表达而得以命名[9-10]。此后,根据luqin型神经肽前体和受体的序列相似性分析在两侧对称动物中发现了该家族的其他成员,但在后口脊索动物中尚未见报道[11],相较于其他神经肽信号系统,针对luqin型神经肽信号系统功能的研究较少,目前对功能表征的研究表明luqin型神经肽是进化上古老的摄食行为调节子[12-16],在运动[10,17]和繁殖[18-19]方面也有一定的调节作用。在对棘皮动物的研究中,Yaez-Guerra等[10]利用原位杂交技术对成体红海盘车(Asteriasrubens)不同组织中luqin型神经肽前体ArLQP进行了定位分析,并利用体外药理学实验进行了初步的功能表征,但尚未见luqin型神经肽在棘皮动物早期发育阶段中的分布及表达特征的研究。

大多数棘皮动物为间接发育类型,即在由变态过程过渡到生殖活跃的成年阶段前,会经历一个或多个幼体阶段[20],幼体和成年棘皮动物具有完全不同的解剖结构和生活方式。对棘皮动物幼体中神经肽及其前体进行定位和定量分析,将丰富神经肽信号系统在棘皮动物幼体中潜在功能的认识,为棘皮动物神经肽的比较生理学研究奠定基础。Mayorova等[21]利用整胚原位杂交技术对红海盘车8种神经肽前体(L型SALMFamide、F型SALMFamide、NGFFYamide、加压素/催产素型、促甲状腺激素释放激素型、促性腺激素释放激素型、降钙素型和促肾上腺皮质激素释放激素型)在羽腕幼虫和短腕幼虫发育阶段的分布进行了表征。结果表明,这8种神经肽前体都在附着复合体中表达,部分神经肽前体的表达与纤毛带相关。Wood等[22]利用原位杂交和免疫组化技术对紫海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)的9种神经肽及其前体在其幼虫中的分布表达进行了研究,鉴定到表达一种或多种NP基因的几个细胞亚群,它们主要位于顶端器官、臂基部、口周、纤毛带以及中肠和前肠中。目前,关于刺参(Apostichopusjaponicus)早期发育阶段神经肽分布及表达特征的研究尚未见报道。

刺参是我国重要的水产养殖对象之一,具有很高的营养和药用价值,近年来刺参增养殖产业迅速发展的同时也带来了巨大的挑战。要保证刺参增养殖产业的持续、高效发展,亟待深入开展刺参生物学特征尤其是神经生理学的研究。本研究选取刺参典型的早期发育阶段(囊胚期、原肠胚期、耳状幼虫期,樽形幼虫期和五触手幼虫期[23-25]),利用免疫荧光和荧光定量技术初步探究了刺参luqin型神经肽AjLQ及其前体基因AjLQP在刺参典型的早期发育阶段的分布表达特征,以期为研究luqin型神经肽在刺参早期发育阶段中生理功能提供见解。

1 材料和方法

1.1 实验动物和处理

刺参典型早期发育阶段的胚胎和幼体采自青岛市胶南灵山卫刺参养殖厂,将刺参胚胎或幼体于PBS中冲洗并置于4% PFA中4 ℃固定过夜,随后依次用25%、50%、75%和100%甲醇进行处理,处理好的样品用于后续免疫荧光实验或置于-20 ℃甲醇中长期保存;用冻存管收集刺参早期发育阶段的样品,于液氮中速冻并保存在-80 ℃超低温冰箱中,用于后续荧光定量分析。

1.2 抗体制备

针对AjLQ(KPYKFMRW-NH2)的一抗由Abmart (China) 生产。首先,化学合成多肽AjLQ并偶联载体蛋白KLH,将其作为抗原来免疫兔子,处死后取血,进行抗体抗原亲和纯化;然后,利用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)验证一抗效价。

1.3 免疫荧光

用吸管将刺参不同发育阶段的胚胎和幼体吸至载玻片,37 ℃烤片至样品附着在载玻片上。3%过氧化氢处理25 min阻断内源性过氧化物酶,PBST洗涤3×5 min,用5%山羊血清室温封闭30 min,按一抗∶PBS=1∶200的比例稀释,4 ℃孵育过夜(阴性对照为分别滴加PBS或免疫前血清或预吸收AjLQ的一抗)。PBST洗涤3×5 min,按二抗∶PBS=1∶2 000的比例稀释二抗(FITC标记, absin, China),室温孵育50 min。PBST洗涤3×5 min,滴加DAPI染液(G-clone,China)孵育3 min;荧光显微镜 (Olympus, Japan) 观察拍照。

1.4 总RNA提取

采用Trizol法提取早期发育各阶段的刺参总RNA。将组织在液氮中研磨成细粉状,加入Trizol (Vazyme, China),4 ℃,14 000 r/min离心10 min;取上清液加入到含氯仿的新离心管中,涡旋混匀15 s至乳浊液,静置5 min;4 ℃,14 000 r/min离心15 min;吸取适量上清液至新的离心管,加入等体积异丙醇,上下轻轻颠倒混匀30 s后4 ℃静置15 min;4 ℃、14 000 r/min离心10 min;倒去上清液,加入75%乙醇,轻弹管底使沉淀悬浮,上下颠倒数次后静置5 min,4 ℃、12 000 r/min离心5 min,重复该步骤一次;倒去上清,14 000 r/min离心1 min。用枪头吸干液体,室温晾干10 min。根据沉淀的多少,加入适量DEPC水,溶解30 min后混匀。随后立即使用Biodropsis BD-1000核酸分析仪(OSTC, China) 和琼脂糖电泳(Liuyi, China) 检测提取总RNA的浓度和质量,保存于-80 ℃待用。

1.5 cDNA克隆与荧光定量

使用Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)试剂盒(Yeasen, China)对早期发育各阶段的刺参胚胎和幼体cDNA进行全长扩增,使用Hieff UNICON©Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(Yeasen, China)和Corbett Rotoe-Gnen Q(Qiagen, Germany) qPCR仪进行荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR),操作步骤参照试剂盒说明书。添加熔解曲线验证PCR反应产物的特异性。以β-actin和β-tubulin为双内参,采用2-ΔΔCT方法分析AjLQP基因表达量的变化,利用SPSS 22.0软件对数据进行ANOVA方差分析,用平均值±标准误(Mean ± S.E.M.)来表示相对表达量。P<0.05为差异显著。所用引物序列如表1所示。

表1 荧光定量所用引物序列

2 结果

2.1 AjLQ在刺参早期发育阶段的分布特征

ELISA结果显示了抗AjLQ抗体的效价(见图1)。100 ng的AjLQ抗原肽与制备的抗AjLQ抗体在实验所用的1∶200稀释度下仍具有较好的反应性,而未与免疫前血清发生反应。

(■:添加免疫前血清;●:将一抗稀释相应倍数后添加100 ng AjLQ抗原。每个稀释倍数进行两次重复,数据表示为平均值±标准误。■: Adding pre-immune serum; ●: Adding 100 ng AjLQ antigen to primary antibody with corresponding dilution. Data represents mean±SEM from two replicates.)

在刺参早期发育阶段,AjLQ免疫荧光阳性信号始见于旋转脱膜囊胚期的间质(见图2 A)。发育至原肠胚时,AjLQ分布于向内凹陷的胚孔处(见图2 B)。

(A: 囊胚期; B: 原肠胚期。 VP: 植物极; Me: 间质; Bl: 囊胚腔; Be: 胚孔。 比例尺: 50 μm。A: Blastula stage; B: Gastrula stage. VP: Vegetal pole; Me: Mesenchyme; Bl: Blastocoel; Be: Blastopore. Scale bars: 50 μm.)

刺参幼体从耳状幼虫期开始摄食[24,26]。在耳状幼虫早期,刺参幼虫的消化道开始明显分化,此时在口部可见AjLQ免疫荧光阳性信号(见图3 A)。随着耳状幼虫进一步发育,可以观察到AjLQ在口、食道、肛前环和肛门(见图3 B)及前背脊、中背脊、后背脊和后侧脊等处纤毛带的阳性信号(见图3 C),且多集中于幼虫反口端。

(A: 耳状幼虫早期; B: 耳状幼虫中期; C: 耳状幼虫后期。 Mh: 口; Es: 食道; As: 肛门; PL: 口前环; PL*: 肛前环; AD: 前背脊; MD: 中背脊; PD: 后背脊; PL: 后侧脊。 比例尺: 50 μm。 A: Early auricular stage; B: Middle auricular stage; C: Late auricular stage. Mh: Mouth; Es: Esophagus; As: Anus; PL: Preoral loop; PL*: Preanal loop; AD: Anterior dorsal ridge; MD: Mid-dorsal ridge; PD: Posterior dorsal ridge; PL: Posterior lateral ridge. Scale bars: 50 μm.)

在樽形幼虫期,AjLQ主要分布于纤毛环和内部器官团中(见图4 A)。在五触手幼虫期的纤毛环和口触手中也观察到了AjLQ免疫荧光阳性染色(见图4 B)。

2.2 AjLQP在刺参早期发育阶段的表达特征

如图5所示,AjLQP在刺参囊胚期的表达量最低,在原肠胚期有所上升,耳状幼虫期表达量显著高于其他4个阶段(P<0.05)。

3 讨论

本研究率先结合免疫荧光和荧光定量PCR技术解析了luqin型神经肽在刺参典型早期发育阶段——囊胚期、原肠胚期、耳状幼虫期、樽形幼虫期和五触手幼虫期的定位特征,测定了luqin型神经肽前体基因在这些早期发育阶段的表达特征,为后续鉴定神经肽在刺参早期发育阶段的生理功能奠定基础。

刺参luqin型神经肽前体在耳状幼虫期显著上调表达,而耳状幼虫期的显著特征之一是摄食开始[24,26],在刺参早期发育阶段游泳、摄食相关组织[21](耳状幼虫的口、食道、肛前环、肛门和纤毛带,樽形幼虫和五触手幼虫的纤毛环)中也发现了AjLQ免疫荧光阳性信号,由此我们推测luqin型神经肽可能参与刺参幼虫的游泳和摄食调控。我们在刺参成体luqin型神经肽功能表征的研究中同样发现luqin型神经肽是刺参运动和摄食潜在的调节子(未发表数据)。类似的,在对棘皮动物成体的研究中,Yaez-Guerra等[10]利用原位杂交技术对成体红海盘车不同组织中luqin型神经肽前体ArLQP进行了定位分析,发现ArLQP在成体海盘车运动器官(管足)、消化系统的贲门胃和幽门胃中有所分布,体外药理学实验进一步表明ArLQP可能参与了红海盘车运动和摄食方面的调节[10]。此外,luqin型神经肽类似的潜在功能也在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)[17]、绿头蝇(Phormiaregina)[13-14]和虾(Marsupenaeusjaponicus)[16]等物种中被报道。Nakano等[27]使用3种一抗对刺参幼体神经元进行免疫荧光标记,在耳状幼虫、樽形幼虫和五触手幼虫时期,沿纤毛带/环观察到大量阳性信号,这与我们观察到的luqin型神经肽的免疫荧光阳性信号分布区域重叠。有研究发现,棘皮动物幼虫的神经系统可能通过控制纤毛带的摆动方向以及食道和幼虫臂的肌肉组织来控制游泳和摄食[28],这暗示了包括AjLQ在内的神经肽作为神经系统的重要调节因子,可能是通过控制纤毛摆动从而调节刺参早期发育阶段的游泳和摄食行为。本研究结果表明了luqin型神经肽在棘皮动物幼体和成体中的功能保守性,但仍需对其进行进一步的药理学表征。未来,神经肽在棘皮动物早期发育阶段和成体中的比较生理学研究可以扩充我们对神经肽生理功能的认知,并有助于理解神经肽信号系统的进化。

口触手和管足是海胆、海参和海蛇尾幼虫的主要粘附器官[29-30],而粘附对包括棘皮动物在内的海洋无脊椎动物的生长发育至关重要[31]。有研究表明,粘附器官中与附着和分离相关的分泌细胞受神经分泌样细胞的调节,在其中表达的神经肽可能参与控制幼虫的附着相关过程[21,32]。AjLQ在五触手幼虫期口触手中的阳性表达表明其在幼体粘附过程中的潜在调控作用, Mayorova等[21]同样发现红海盘车的8种神经肽前体(L型SALMFamide、F型SALMFamide、NGFFYamide、加压素/催产素型、促甲状腺激素释放激素型、促性腺激素释放激素型、降钙素型和促肾上腺皮质激素释放激素型)在羽腕幼虫和短腕幼虫附着复合体中的表达,这表明神经肽在棘皮动物早期发育阶段的潜在生理功能上有一定的共性。

4 结语

本研究利用免疫荧光和荧光定量技术初步探究了luqin型神经肽信号系统在刺参典型早期发育阶段的分布及表达特征。AjLQ免疫荧光阳性信号主要分布在游泳、摄食和附着相关器官中,AjLQP基因在刺参耳状幼虫期表达量达到最高且与其他阶段有显著性差异。研究结果提示,luqin型神经肽可能参与了刺参幼虫的游泳、摄食和附着调控。