基于线粒体形态与功能的白腰雪雀高原适应性研究

吕博文，马永贵，2，3，李国刚，2，3，郝玉馨，赵建芝，马玉梅，贺玉姣，2，3

（1.青海师范大学生命科学学院，西宁，810008；2.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，西宁，810008；3.高原科学与可持续发展研究院，西宁，810008）

青藏高原素有“地球第三极”之称，因低温、低氧和强紫外线辐射等独特的环境，而具有丰富且珍贵的生物资源。白腰雪雀（Onychostruthus taczanowskii）属雀形目（Passeriformes）雀科（Passeridae），是我国青藏高原特有鸟类［1］，通常栖息在海拔3 000～4 500 m的高山、草甸及荒漠地带［2］，作为世代生活于高原的留鸟，白腰雪雀经过漫长的进化，已经能够很好地适应高原极端环境，并形成了独特的高原适应生理机制［3］。

线粒体是细胞内具有两层膜结构的半自主细胞器，其内膜上的呼吸链复合体通过与氧化磷酸化偶联，消耗了细胞内约90%的O2，产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），在维持生物机体体温恒定的同时，为生物体的各项生命活动提供动力［4］。胸肌在鸟类机体中是占比最大的肌肉群［5］，不仅为鸟类飞行与觅食提供动力，也在体温调节方面扮演着重要角色［6-10］，鸟类胸肌在机体产热能力方面起着显著作用，胸肌线粒体的结构和大小对鸟类产热能力有明显影响［11-12］。另有研究表明［13-14］，生活在高原的动物由于长期对高海拔环境的适应，心脏在结构上发生了一定改变。心脏是全身组织氧供应的动力中心，与胸肌工作模式不同，能量代谢以有氧代谢为主，心脏功能的强弱及心肌细胞获氧效率的高低，与心肌线粒体关系密切［15］。心肌细胞中线粒体的数量、功能和结构决定了心脏的能量供应，心肌线粒体对于机体低氧适应有不可替代的作用［16-17］。

既有的关于鸟类高原适应性研究主要集中于鸟类体内运氧机制的探讨，而在亚细胞水平上关于鸟类对高原环境的适应机制和对氧气利用的研究较少。本研究利用显微体视学技术和分光光度法，通过比较不同高海拔地区白腰雪雀与低海拔地区麻雀（Passer montanus）胸肌与心肌组织线粒体的形态特征和线粒体呼吸链上4 个复合体酶的活性，研究白腰雪雀在高原环境中胸肌和心肌组织在结构与功能上的适应性变化，以期为解析鸟类高海拔适应机制，理解脊椎动物高原适应性演化和预防人类高原疾病提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 动物

白腰雪雀分别于青海省果洛藏族自治州（下称“果洛地区”）和青海省海北藏族自治州（下称“海北地区”）捕获，麻雀于陕西省榆林市（下称“榆林地区”）捕获，后处以安乐死并解剖，解剖后获得组织，相关信息详见表1。本研究已取得相关管理部门许可，符合动物伦理要求，取样时间为2021年7月。

表1 样本采样信息Tab.1 Information on sampling sites

1.2 方法

1.2.1 胸肌线粒体形态学参数测定

按照采样地区将样品分为3组，每组动物取4只制作组织切片后进行电镜检测，具体方法：于动物前胸和心脏处取1 mm×1 mm×1 mm 的肌肉组织，取材时避开血管、脂肪组织。将取好的肌肉组织立即置入2.5%戊二醛电镜固定液，4 ℃固定24 h，而后使用1%锇酸二次固定，经丙酮脱水处理后包埋。从每组包埋块中选取2个，用超薄切片机（LKB-2188，瑞典）行70 nm 超薄切片后，使用醋酸铀和枸橼酸铅对切片双重染色。使用透射电镜（JEM-2000EX，日本）观察染色后的切片。每个肌肉包埋块随机拍摄10 个视野（7 500×），避开血管等组织。

参照郑富盛［18］的方法，使用方格测量系统对细胞形态进行定量描述，以点分析法测量线粒体面数密度（numerical density on area，NA）、体密度（volume density，VV）、面密度（surface density，SV）、平均截面面积（mean section area，MS）和比表面（specific surface，δ），相关数据用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测量。胸肌和心肌组织线粒体数目测量时，对于边缘不完整的线粒体，以计左不计右、计上不计下的原则计数。

1.2.2 线粒体呼吸链复合体酶活性测定

线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性的检测按照CheKine™线粒体呼吸链复合体活性检测试剂盒（Cat#：KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1880）说明书进行。复合体Ⅰ活性以每毫克组织蛋白每分钟消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的量（µmol）表示；复合体Ⅱ活性以每毫克组织蛋白每分钟消耗2，6-二氯吲哚酚的量（µmol）表示；复合体Ⅲ活性以每毫克组织蛋白每分钟消耗还原型泛醌的量（µmol）表示；复合体Ⅳ活性以每毫克组织蛋白每分钟消耗还原型细胞色素C的量（µmol）表示［19］。计算公式如下：

式中：W为样本鲜质量（g）；ΔA1为提取胞浆上清液反应前后吸光值差值；ΔA2为提取线粒体反应前后吸光值差值。

1.2.3 统计分析

使用IBM SPSS Statistics 26 软件进行数据处理，采用Shapiro-Wilk 检验所用数据的正态性，用oneway ANOVA 进行方差分析，采用Duncan’s test 进行多重比较，使用GraphPad Prism 9.4制图。

2 结果

2.1 胸肌与心肌组织线粒体超微结构

透射电镜观察发现，果洛地区和海北地区白腰雪雀胸肌与心肌组织线粒体多呈颗粒状，线粒体嵴密集，分布均匀，线粒体膜完整（图1A、B、D、E）。榆林地区麻雀胸肌与心肌组织线粒体多呈圆状，截面积大，线粒体膜完整（图1C、F）。

图1 白腰雪雀、麻雀胸肌组织和心肌组织线粒体透射电镜结果Fig.1 Transmission electron microscopy of the mitochondria in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo）， O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

2.2 胸肌组织线粒体形态参数

白腰雪雀和麻雀的胸肌组织线粒体形态参数测定结果如图2 所示。较高海拔的果洛地区白腰雪雀胸肌组织线粒体的NA、VV、SV、Ms 和δ均大于较低海拔的海北地区，其中NA（p＜0.01）、VV（p＜0.001）、SV（p＜0.01）和δ（p＜0.05）具有显著差异，而MS无显著差异。白腰雪雀胸肌组织线粒体的NA、SV和δ均大于麻雀，其中白腰雪雀的δ（p＜0.000 1）、NA（果洛地区p＜0.001）和SV（果洛地区p＜0.01）具有显著差异；白腰雪雀的Ms 极显著低于麻雀（p＜0.000 1）；麻雀的VV显著高于海北地区的白腰雪雀（p＜0.001），与果洛地区白腰雪雀数值相近。

图2 果洛地区、海北地区白腰雪雀及榆林地区麻雀胸肌组织线粒体形态参数Fig.2 The comparison of parameters about pectoral mitochondria in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo）， O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

白腰雪雀和麻雀的心肌组织线粒体形态参数测定结果如图3 所示。果洛地区白腰雪雀心肌组织线粒体的NA、VV、SV、MS和δ均大于海北地区，其中VV（p＜0.01）、SV（p＜0.05）和δ（p＜0.05）具有显著差异，而NA和MS无显著差异。白腰雪雀心肌组织线粒体的NA（果洛地区p＜0.01、海北地区p＜0.05）和δ（p＜0.000 1）均显著大于麻雀；白腰雪雀的MS（p＜0.000 1）和VV（果洛地区p＜0.05、海北地区p＜0.000 1）显著低于麻雀；麻雀的SV高于海北地区的白腰雪雀，与果洛地区的数值相近，均无显著性差异。

图3 果洛地区、海北地区白腰雪雀及榆林地区麻雀心肌组织线粒体形态参数Fig.3 The comparison of parameters about myocardial mitochondria in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo）， O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

2.3 线粒体呼吸链复合体酶活性

白腰雪雀和麻雀的胸肌组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ酶活性结果如图4 所示。果洛地区白腰雪雀胸肌线粒体的4 个复合体酶活性均大于海北地区，其中复合体Ⅰ（p＜0.01）和复合体Ⅱ（p＜0.000 1）具有显著差异，而复合体Ⅲ和复合体Ⅳ无显著性差异。与麻雀相比，白腰雪雀胸肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ（果洛地区p＜0.01）、复合体Ⅱ（果洛地区p＜0.000 1，海北地区p＜0.01）、复合体Ⅲ（p＜0.001）和复合体Ⅳ（p＜0.000 1）的酶活性均显著升高。

图4 果洛地区、海北地区白腰雪雀及榆林地区麻雀胸肌组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性Fig.4 The comparison of activities about pectoral mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo），O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

白腰雪雀和麻雀的心肌组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ酶活性结果如图5 所示。果洛地区白腰雪雀心肌线粒体的4 个复合体活性均大于海北地区，复合体Ⅰ（p＜0.000 1）、复合体Ⅱ（p＜0.01）、复合体Ⅲ（p＜0.001）和复合体Ⅳ（p＜0.000 1）均具有显著差异。与麻雀相比，白腰雪雀心肌线粒体复合体Ⅰ（果洛地区p＜0.000 1）、复合体Ⅱ（果洛地区p＜0.000 1，海北地区p＜0.01）、复合体Ⅲ（果洛地区p＜0.000 1，海北地区p＜0.001）和复合体Ⅳ（果洛地区p＜0.000 1，海北地区p＜0.01）的酶活性均显著升高。

图5 果洛地区、海北地区白腰雪雀及榆林地区麻雀心肌组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性Fig.5 The comparison of activities about myocardial mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo），O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

3 讨论

线粒体是细胞内的氧浓度感受器，是氧气在体内的最终受体，它利用氧气为细胞的各项生命活动提供能量并维持机体的体温恒定。本研究通过电镜观察后发现，与低海拔麻雀相比，白腰雪雀胸肌和心肌组织线粒体的MS显著减小，与陈付菊等［19］研究的短时低氧胁迫导致青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）肌肉线粒体增大的结果不一致，而张勤文等［20］在对牦牛（Bos grunniens）低氧适应性研究中发现，牦牛骨骼肌线粒体的MS显著小于平原黄牛（B.taurus），与本研究结论一致。推测结论差异的原因是线粒体对于短时低氧的应激反应和已经产生遗传效应的世代低氧适应机制不同。进一步分析发现，海北地区白腰雪雀胸肌和心肌组织线粒体的NA显著大于麻雀，而VV则显著小于麻雀，推测白腰雪雀可能通过增加细胞内线粒体的数量、减小单位线粒体的体积，从而增加了线粒体与胞内氧气接触的机会，使线粒体更充分地利用进入细胞内的O2，产生更多数量的ATP，这一推测在张勤文等［20-21］的研究中得到支持。由于白腰雪雀是短距离垂直飞行和降落的留鸟，没有长距离的迁徙活动，对飞行能量需求相对较少，而胸肌中线粒体数量及比表面的增加，可能是为了产生足够的热量，应对高原环境带来的低温挑战。

不同海拔白腰雪雀的胸肌和心肌组织线粒体形态研究表明，生活于4 200 m 的白腰雪雀，VV、SV和δ均显著大于3 102 m 的白腰雪雀，NA也有以上关系，但只在胸肌组织的线粒体中具有显著差异，这与Widmer 等［22］和Costa 等［23］的研究结果一致。这种形态变化可能一方面使生活在更高海拔的白腰雪雀组织线粒体的膜具有更大的向外扩张程度，与外界接触面积更大，另一方面缩短了体内组织中氧的弥散距离，进而提高线粒体对氧的摄取和利用效率［18，24］。

线粒体内膜上附着大量参与能量代谢的酶。高原动物可以通过优化呼吸链上的反应体系，提高呼吸链作用效率的方式来应对高原恶劣环境的胁迫［25］。本研究分析2 个地区的白腰雪雀胸肌和心肌组织线粒体相关酶活性参数发现，生活在4 200 m 的白腰雪雀线粒体呼吸链上4 个复合体的酶活性较生活在3 102 m 的白腰雪雀均有不同程度的升高，这与陈付菊等［19，26］的结论一致。同时，本研究亦对比了白腰雪雀与麻雀的相关差异，发现白腰雪雀胸肌和心肌组织线粒体上4 个复合体的酶活性均大于麻雀对应的复合体，且除胸肌复合体Ⅰ外，其余均达显著水平，这与尹松月［27］发现产生低氧适应的果蝇（Drosophila）胸肌线粒体呼吸链复合体的酶活性高于正常果蝇的结论一致。通过比对已公布的白腰雪雀与低海拔麻雀的线粒体基因组（NC_025914.1，NC_024821.1），发现二者与线粒体呼吸链复合体相关基因存在较多非同义突变，这可能是促使白腰雪雀线粒体4个复合体活性升高的原因之一。

4 结论

在高原低温、低氧环境下，白腰雪雀可通过减小胸肌和心肌组织线粒体体积，增加线粒体的数量和膜利用率，同时提高线粒体呼吸链上4 个复合体酶活性的方式，使白腰雪雀在高原恶劣环境中能产生足够能量，保障机体的各项生理活动，维持体温恒定，从而在青藏高原得以持续地生存和繁衍。