盐酸川芎嗪对冷暴露小鼠肝脏中解偶联蛋白1 表达的影响

孟凡舜，李仕韦，夏榕鸽，赵天睿，刘鼎鑫，李鹏

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

对于我国北方高寒地域的动物，特别是对新生的动物而言，冷应激是较为常见的一种应激源。在北方高寒地域，初春的雏鸡孵化、初春末秋的母猪产崽以及冬天的母牛产犊等，冷应激对于畜牧业的迅速发展都是需要重视的必要环节[1]。然而，由低温环境所引起的冷应激往往会导致动物生长速度减慢、抗病能力变差，甚至导致动物死亡等问题。严重的冷应激会对动物产生较大的影响，除了会降低其生产性能，还可引发动物呼吸系统疾病，甚至导致动物死亡[2]。即使动物适应冷应激后，也会引起基础代谢率和采食量提高，导致动物的能量储备及生产性能有所降低，进而影响生产效益。综上可知，低温环境所引起的冷应激是影响我国北方畜牧业发展的重要因素之一。

动物体内的能量资源不是无限的，当体内某一系统所需能量增加时，为适应自身变化，机体会对自身能量的利用进行重新分配，以维持自己的生命。当外界温度降低时，恒温动物首先通过非战栗性产热来增加产热，当达到临界点时，就会发生战栗。作为三大营养物质的糖类、脂肪和蛋白质是机体热量的主要来源。而肝脏是许多生理过程的关键枢纽，作为机体内物质代谢最旺盛的器官，它也是机体主要的产热器官之一。肝脏与三大营养物质代谢之间存在着十分密切的关系，它是糖异生、调节血糖浓度以及将体内糖转化为脂肪的主要器官，并在脂类代谢过程中发挥着重要作用，同时肝脏内蛋白质的代谢也很活跃。在进食时，肝脏以糖原形式储存葡萄糖，空腹时则通过糖异生途径组装葡萄糖，肝脏能够氧化脂肪，也可将多余的脂肪进行包装，以分泌和储存到其他组织，肝脏还负责血液中分泌的大多数蛋白质，能够处理用于能量的氨基酸，还可通过以尿素新陈代谢的形式处理蛋白质降解所产生的含氮废物[3]。当机体处于寒冷环境中时，肝脏的代谢活动会有所增强，以此提高机体热量，同时也为骨骼肌的战栗性产热提供能量。因此，在处于寒冷环境的情况下促进肝脏产热对动物机体抵御低温环境具有重要意义。

川芎，伞形科藁本属植物，在《神农本草经》中被列为上品，又名香果，其性温，味辛，常用于活血行气、祛风止痛，在散偏汤、四物汤、温经汤等方剂中均可见其身影。川芎中所含化学成分众多，如川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯、丁基苯酞等。川芎嗪（ligustrazine，TMP）是从中草药川芎中分离得到的一种活性生物碱，化学名称为2，3，5，6-四甲基吡嗪，于1957 年首次被分离，具有2000 多年的广泛药用历史。在我国川芎嗪被广泛用于心脑血管疾病，至今已有40 多年的历史，同时由于其对机体多个系统均表现有效性，而受到了广泛关注[4]。在过去的几十年里，研究人员探索了TMP 在各种疾病中的药理作用，例如心脑血管缺陷[5-6]、脂肪肝[7-8]、胰腺炎[9]、Ⅱ型糖尿病[10-12]及癌症[13-15]等，验证了其保护肝脏和肾脏[16-17]、抗氧化[18]、抗炎[19]及抗肿瘤活性[20]等作用。

盐酸川芎嗪是川芎嗪最常用的药物制剂，在临床中具有良好的使用效果，稳定性更好，半衰期较川芎嗪更长和副作用较小等特点。介于上述背景，盐酸川芎嗪在冷暴露中尚未有研究。因此，试验选择盐酸川芎嗪作为治疗药物，探究其在冷暴露条件下对小鼠肝脏产热能力的影响，为提高畜禽冬季抗寒能力提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

4%多聚甲醛、苏木精染色剂、伊红染色剂、油红O 染色试剂盒、RIPA 裂解液、PMSF 蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、SDS-PAGE 制胶试剂盒、SDA-PAGE 蛋白上样缓冲液（5X）购自上海碧云天公司；蛋白marker、底物发光液、PVDF 膜购自美国MILLIPORE 公司；UCP1 兔多克隆抗体、β-Tublin 鼠单克隆抗体、HRP 标记的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 购自美国Proteinch 公司。

1.2 实验动物

4 周龄雄性SPF 级C57BL/6J 小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司。将其随机分为常温对照组（N 组）、冷暴露组（CN 组）、冷暴露+50 mg·kg-1盐酸川芎嗪组（C50 mg·kg-1组）以及冷暴露+100 mg·kg-1盐酸川芎嗪组（C100 mg·kg-1组），每组10 只，昼夜交替光照12 h，自由饮水，室温（26±1）℃预饲一周后对加药组小鼠进行相应浓度的灌胃，灌胃组在灌胃结束后与冷暴露组一起每天置于4 ℃人工气候室中冷刺激3 h，4 周后处死小鼠，并采集肝脏组织。

1.3 HE 染色

将肝脏组织固定于4%多聚甲醛缓冲液，置于包埋盒中，流水冲洗30 min，利用不同浓度的酒精脱水，在二甲苯溶液中使组织透明后，将透明组织放在石蜡中，包埋后进行切片。染色前，采用二甲苯溶液脱蜡后，放入从高到低浓度的酒精中，再用蒸馏水清洗。将切片置于苏木精染液中几分钟，然后放于盐酸乙醇和氨水中各30 s 进行分色，再用伊红染色液染色2~3 min，再通过不同浓度的酒精脱水，利用二甲苯溶液透明后封片。在×200 放大倍率下观察各组肝脏是否有损伤。

1.4 油红O 染色

取肝脏组织，将其包埋在OCT 化合物中，并置于-80 ℃条件下保存。利用冰冻切片机以10 μm 的厚度切割组织。采用异丙醇配制0.5%的油红O 原液，工作浓度60%用DDH2O 稀释。用60%异丙醇对切片进行洗涤，用油红O 工作液染色1 h，染色完成后用自来水冲洗切片20 min。在×200 放大倍率下对各组肝脏中脂滴数量进行观察。

1.5 UCP1 免疫组织化学法检测

将固定后的肝脏组织进行固定和脱水处理，将处理后的组织包埋在石蜡中，包埋后的肝脏组织用切片机切成5 μm 厚的切片，将处理后的切片进行脱蜡和抗原修复。处理完毕后，对切片进行血清封闭然后加一抗4 ℃孵育过夜。一抗孵育结束后加入二抗37 ℃孵育30 min，二抗孵育结束后加入SABC 37 ℃孵育30 min，孵育结束后加入显色剂，将显色后的切片加入苏木精复染，复染结束后进行脱水和封片。

1.6 UCP1 蛋白表达水平的检测

用RIPA 提取肝脏组织中的总蛋白质，提取后在4 ℃和12 000RCF 的条件下离心10 min。离心结束后收集上清液用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液使其变性。将每个样品等量的加入SDS-PAGE 凝胶上并进行电泳。电泳后，将蛋白转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉封闭PVDF 膜2 h，封闭结束后孵育一抗（1∶1 000）8 h，加入HRP 标记的山羊抗兔和山羊抗鼠（1∶10 000 稀释）孵育1 h。用ChemiDoc XRS+（Bio-Rad，USA）凝胶成像系统检查印迹，并用Image-J 软件分析目的蛋白与内参的灰度比值。

1.7 统计学分析

利用Graphpad-prism8.0 进行统计分析和绘图，采用单因素方差分析方法分析数据，结果采用平均数±标准差进行表示（±s），P＜0.05 表示差异具有显著性；P＜0.01 表示差异具有极显著性；P＜0.001 表示差异极其显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠肝脏组织病理变化

HE 染色结果如图1 所示。经观察，各组肝细胞形态正常、染色均匀，小鼠肝脏组织并未出现炎性浸润等炎症现象，盐酸川芎嗪并未引起肝脏损伤。说明试验所选的盐酸川芎嗪添加浓度属于安全范围。

图1 小鼠肝脏组织HE 染色形态图（×200）Fig.1 HE staining morphology of liver tissue in mice（×200）

2.2 小鼠肝脏组织脂滴数量变化

油红O 染色结果如图2 所示，冷暴露条件下添加盐酸川芎嗪后，C50 mg·kg-1组脂滴数大量增多，CN组相对于N 组脂滴少量增多，C100 mg·kg-1组相对于CN 组脂滴数少量增多。说明冷暴露下添加盐酸川芎嗪后大量脂质如甘油三酯等转运至肝脏中，可提高机体的脂质代谢，进而使机体产生热量以维持体温。

图2 小鼠肝脏组织油红O 染色形态图（×200）Fig.2 Morphological map of oil red O staining in mouse liver tissue（×200）

2.3 UCP1 的IHC 结果

IHC（图3）结果显示，冷暴露条件下添加盐酸川芎嗪后，小鼠肝脏组织中的UCP1 表达量提高，其中C50 mg·kg-1组的表达量最高，说明添加盐酸川芎嗪可促进小鼠肝脏组织产热。

图3 小鼠肝脏组织IHC 结果图（×200）Fig.3 IHC results of mouse liver tissue（×200）

2.4 UCP1 蛋白表达水平

通过Western Blot 对产热关键蛋白UCP1 进行了检测，结果如图4 所示。相较于CN 组，C50 mg·kg-1组及C100 mg·kg-1组小鼠肝脏中的UCP1 均有显著升高，其中C50 mg·kg-1组升高更多。由此可见，添加盐酸川芎嗪可以提高肝脏产热蛋白表达，促进肝脏产热来维持体温。

图4 Western blot 检测各组肝脏中UCP1 蛋白表达水平Fig.4 The expression of UCP1 protein in liver of each group detected by western blot

3 讨论

寒冷是北方冬季气候的代名词，冷应激是北方一种常见的应激源。冷应激会给动物的生长繁殖、免疫功能、生产性能等方面带来许多不良影响。当动物受到冷应激刺激时，作为一个整体，机体会通过神经—内分泌途径对体内全部的器官和组织进行动员，以应对寒冷应激源带来的刺激。如交感—肾上腺髓质系统经过一系列反应会使儿茶酚胺类激素分泌增多，从而促进机体分解肝糖原、肌糖原和脂肪来升高血糖，去甲肾上腺素还会收缩血管减少散热；下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴也会发生正反馈调节，其中皮质醇会通过加强代谢、加快糖异生、促进脂肪分解和脂肪酸氧化等来增加机体产热；下丘脑—垂体—甲状腺轴中甲状腺激素能促进三大物质代谢来增加产热[21]。虽然在不断进化和适应环境的过程中，很多动物都拥有了一定的抗寒能力，但仍有许多畜禽因自身所产生的热量无法抵御周围的低温环境或受到其他因素影响而经历寒冷所带来的病痛，甚至走向死亡。因此，冷应激仍应受到重视。

TMP 已被验证在治疗心脑血管疾病和保护肝脏等方面具有一定作用，TMP 可通过抑制炎症因子和p—NF—κB/ROS 信号通路，对高脂饮食所引发的非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏产生保护作用[22]和对反式脂肪酸所导致的大鼠肝脏损伤具有较好的保护效果[23]。机体暴露在寒冷中会引起特定的急性和慢性生理反应[24]，TMP 可以减少砷诱导的活性氧（ROS）的产生、提高谷胱甘肽（GSH）的水平、防止线粒体功能出现障碍、抑制促炎信号的激活以及抑制自噬和细胞凋亡的发展，结合试验结果来看，小鼠肝脏并未出现损伤现象，这与前人研究基本一致。肝脏是甘油三酯（TG）的主要合成场所，冷暴露会增强机体物质代谢，因此机体生成的TG 也会随之增多。同时，甘油三酯是机体内重要的储能物质，其储量最大、产能也最多，在油红O 染色结果中可见冷暴露条件下的肝脏脂滴数量都有所增加，其中C50 mg·kg-1组脂滴数最多，说明冷暴露下添加盐酸川芎嗪可以提高肝脏的产热能力。

UCP1 是一种线粒体内膜蛋白，属于线粒体载体家族。当UCP1 被激活时，它会使线粒体内膜两侧的跨膜质子浓度差被消除，减慢氧化磷酸化过程，使三磷酸腺苷（ATP）的形成受阻，从而将营养能量直接转化为热量，以增加机体产热。UCP1 特异性表达存在于线粒体内膜，通过解偶联氧化磷酸化产热，而其产热受冷暖中枢的兴奋调控[25]。与此同时下丘脑通过与摄食中心连接到相对应产热系统中，以控制体温和体重调节。

UCP1 可通过高效能的介导其质子渗漏，使质子梯度中贮存的势能转化成热能而散失，并增加机体的非震颤性产热，为动物保温、御寒以及维持高等哺乳动物恒定的体温，还可预防因能量代谢不平衡带来的Ⅱ型糖尿病和肥胖症。虽然体力活动可消耗多余能量，但多余的能量会通过线粒体UCP1 解偶联棕色脂肪细胞氧化磷酸化，转化为保护自身免受低温影响的生热系统。此外，UCP1 可与游离脂肪酸相互作用催化质子从线粒体膜间到基质的热生成净转移，尽管在大型哺乳动物中所占的比重较低，但其对小型哺乳动物的静息能量消耗和体重调节都起到重要的作用[26]。研究结果显示，在添加了盐酸川芎嗪后，小鼠肝脏组织UCP1 的表达量显著提高。结合油红O染色结果分析，冷暴露环境下添加盐酸川芎嗪后，可促进机体的脂质代谢，甘油三酯等物质大量转运至肝脏，提高了肝脏的产热能力。同时，盐酸川芎嗪还具有效果稳定，抑制炎性发生发展和氧化应激的损伤的特点。通过添加盐酸川芎嗪来应对北方畜牧业所遭受的冷应激损失，可能是一个安全又有效的方法。

4 结论

实验结果表明，冷暴露下盐酸川芎嗪能够显著提高UCP1 的表达水平，促进小鼠肝脏产热，其中C50 mg·kg-1组的效果最强，为提高畜禽的抗寒能力，降低冷应激对北方畜牧业发展的影响提供了一定的参考。