高原世居藏族和移居汉族人群CYP2C19基因多态性比较分析*

黄菊,格桑罗布,次白,孙雪,扎西曲宗,刘斌云,张瑞

(西藏自治区人民医院a.西藏高原医学研究所,西藏自治区人类适应高原转化医学研究重点实验室,b.药学部,拉萨 850000)

心血管疾病高居中国死亡原因首位,且患病率处于持续上升阶段。高原(西藏)地区因其高海拔低氧环境,对心血管系统有一定影响。研究显示,西藏地区城乡居民心血管病发病率为22.15%[1],且冠状动脉粥样硬化性心脏病死亡率呈逐年上升趋势。氯吡格雷是冠状动脉粥样硬化性心脏病治疗中重要的抗血小板药物,其在体内的代谢受细胞色素P450(CYP2C19)基因影响[2]。而国内外对CYP2C19基因多态性研究显示,不同地区、不同人群突变率存在一定差异[3]。目前对于高原世居藏族人群CYP2C19基因的研究较少,本研究旨在对高原地区藏、汉人群CYP2C19基因型及代谢型进行分析,以期为高原地区心血管疾病的精准防治提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2021年1月至12月在西藏自治区人民医院进行健康体检及住院的世居藏族及移居汉族人群。藏族200例,其中男性100例,年龄(46.2±15.0)岁;女性100例,年龄(43.2±18.4)岁;汉族120例,其中男性60例,年龄(50.6±10.8)岁;女性60例,年龄(35.8±8.8)岁。两组间年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试者长期居住在高原地区,相互间无血缘关系,征得患者同意后,签署经本院临床研究伦理委员会批准的知情同意书(伦理审查编号:ME-TBHP-20),方可纳入本研究。所有研究对象均无遗传病史,年龄18～65岁。

1.2试剂与仪器 血液基因组DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司),人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒(江苏百世诺医疗科技有限公司)。NanoDropOne紫外分光光度计,LightCycler 480Ⅱ PCR仪(瑞士Roche公司)。

1.3方法

1.3.1基因组DNA的提取 收集受试者外周静脉全血1 mL,EDTA-K2抗凝,按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA纯度和浓度,其吸光度(A260 nm/A280 nm)值均在1.8～2.0之间,纯度符合试验要求,DNA样本置于-80 ℃保存。

1.3.2实时荧光定量PCR检测CYP2C19基因多态性 使用荧光PCR法,按照CYP2C19基因多态性检测试剂盒说明书分别针对CYP2C19*2型、CYP2C19*3型位点设计独立的特异性引物和探针,每个反应体系通过两种不同荧光通道(FAM、VIC)检测1个位点的基因多态性。根据对荧光信号的判断,实现检测结果的定性分析。以核糖核酸酶P(RNaseP)基因作为内参照,对检测过程进行监控。循环参数:37 ℃ UNG酶处理1 min;95 ℃预变性3 min;94 ℃变性10 s,61 ℃退火及延伸40 s, 35个循环,于退火及延伸时收集荧光信号。以样本检测中FAM、VIC通道至少有1个Ct值≤32,扩增曲线有明显的指数增长期为有效样本检测。

2 结果

2.1Hardy-Weinberg平衡检验结果 本研究人群CYP2C19等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),表明样本人群该基因频率符合遗传平衡法则,具有恒定性,研究人群来自同一群体,群体基因遗传平衡,代表性较好。

2.2高原地区藏、汉人群CYP2C19基因型和等位基因频率分布 藏族人群CYP2C19基因*1/*1型、*1/* 2型、*1/*3型、*2/*2型、*2/*3型和*3/*3型的分布频率分别为49%、36.5%、6.5%、7.5%、0.5%和0%;快代谢型(EM,*1/*1)、中间代谢型(IM,*1/*2和*1/*3)、慢代谢型(PM,*2/*2、*2/*3和*3/*3)的分布频率分别为49%、43%和8%。汉族人群CYP2C19基因*1/*1型、*1/* 2型、*1/*3型、*2/*2型、*2/*3型和*3/*3型的分布频率分别为47.5%、39%、4%、6%、2.5%和1%;EM、IM和PM的分布频率分别为47.5%、43%和9.5%。藏、汉两族人群基因型及代谢型差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、2。

表1 高原地区藏、汉族不同性别人群的CYP2C19基因型分布[n(%)]

表2 高原地区藏、汉族不同性别人群的CYP2C19等位基因及代谢型分布[n(%)]

2.3高原地区藏、汉人群CYP2C19基因型、等位基因分布及与其他国家及地区人群的比较 与世居西藏藏族人群比较,移居西藏的汉族人群以及俄罗斯人、越南人及青海地区藏族人群的CYP2C19基因型、等位基因分布差异均无统计学意义(P>0.05),而与不丹人、蒙古人的分布差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 高原地区藏、汉人群CYP2C19基因型、等位基因分布及其与其他国家及地区人群的比较

3 讨论

CYP2C19是CYP450的同工酶,是参与体内药物代谢的重要酶之一,由CYP2C19基因编码而来。该基因位于染色体10q24上的细胞色素P450基因簇内,编码1个细胞色素P450超家族的酶。细胞色素P450蛋白是单加氧酶,可催化体内药物代谢及类固醇、胆固醇和其他脂类的合成等多种反应。CYP2C19*2 (c.681G>A;rs4244285)和CYP2C19*3(c.636G>A;rs4986893)变异[9],生成无酶活性的蛋白质,导致酶代谢底物的能力减弱,使血药浓度增高,从而引起相关药物代谢的个体化差异,因此均属于弱代谢者。药物代谢酶CYP2C19的遗传多态性是产生药物代谢速率、反应和毒性等方面个体差异的重要原因之一。由于其遗传多态性在不同种族之间具有较大的差异而受到广泛的研究[10]。

西藏是全国藏族居民最集中的地区,2020年全国第七次人口普查数据显示,西藏藏族人口为313.8万。藏族是中国古老的民族之一,考古人员证实在3万至4万年前已有古人踏足青藏高原的高海拔地区[11],本地居民具有长久独特的遗传背景和生活习惯。本研究结果显示,高原地区藏、汉族人群的CYP2C19基因快代谢型(EM,*1/*1)、中间代谢型(IM,*1/*2、*1/*3)、慢代谢型(PM,*2/*2、*2/*3、*3/*3)分布频率分别为49%、43%、8%和47.5%、42.5%、10%,两组间差异无统计学意义。CYP2C19*1、*2、*3三种等位基因在高原藏族人群的发生频率分别为70.5%、26%和3.5%,与不丹人群基因频率有显著性差异(P<0.05),提示各民族CYP2C19基因多态性分布具有一定特点。在高原移居汉族人群中CYP2C19*1、*2、*3的频率分别为69.1%、26.7%和4.2%,与藏族人群差异无统计学意义(P>0.05),提示独特的地理位置与生活习惯或许并不足以对藏族人群造成CYP2C19基因的改变,也可能是由于基因突变需要数代积累才能显示出差异。

一项对6 060例来自美洲的健康个体进行CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19药物代谢酶基因型分析报道提示,美洲原住民所有基因的野生型等位基因频率较高[12]。另一项研究对5 408例澳大利亚居民进行CYP2D6和CYP2C19等基因的药物基因组进行检测,发现在2 509例使用所列药物的患者中,约96%的患者至少有一种可操作的药物基因组变异,表型转化预测CYP2D6和CYP2C19的不良代谢(PMs)频率增加了5倍[13]。有学者对82 791例健康人进行荟萃(meta)分析CYP2C19和CYP2D6等位基因的频率分布,并绘制CYP2C19和CYP2D6变异的详细欧洲地图,发现与临床相关等位基因的频率在地理上是分级的,反映了欧洲人的迁移历史,表明了生成高空间分辨率药物基因组数据集的重要性[14]。CYP2C19作为生物体内影响药物代谢的重要酶类,其基因分型具有重要意义。本研究由于地域及样本量限制,并未显示出明显的差异,下一步拟进行不同地区间更多样本量的检测,并探讨其对临床合理用药的指导意义。

CYP2C19基因多态性对心血管病、精神病和肿瘤领域药物疗效的影响最显著。对于慢代谢及中间代谢患者,由于体内药物浓度升高,容易引起药物不良反应。本研究表明高原世居藏族和移居汉族人群的中间代谢型及慢代谢型分别占51%和52.2%,此类患者均需个性化调节用药剂量或调整其他抗血小板药,因此,在高原地区服用氯吡格雷前进行CYP2C19基因型检测具有重要意义。