LncRNA H19和miR-625-5p在消化性溃疡合并幽门螺杆菌感染患儿血清中的表达及意义

秦飞,徐文飞,林晓玲,李崇山,苏桂如

(泉州市儿童医院消化内科,福建泉州 362000)

消化性溃疡(peptic ulcer,PU)是一种酸相关性疾病的消化道病变,多发生于胃或十二指肠近端等部位,胃黏膜脱落、缺损延伸至黏膜下层或固有肌层,对各个年龄段均有影响,具有较高的发病率和死亡率[1-2]。研究发现,幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,HP)感染是PU的主要危险因素,可诱发炎症反应,进一步加重胃黏膜损伤以及溃疡[3-4]。因此,寻找与PU合并HP感染相关的生物学标志物有助于临床尽早对患儿进行治疗,保障患儿的生命健康。长链非编码RNA(LncRNA)是炎症和血管功能的关键介质。LncRNA H19作为LncRNA的一种,可以进行自噬调节,激活炎症途径,与炎症性疾病密切相关。有研究显示,LncRNA H19高表达的HP感染患者患胃癌的风险增大,其会通过增强炎症反应,促进HP感染的胃癌细胞增殖和迁移[5-6]。微小RNA-625-5p(miR-625-5p)是一种多功能miRNA,能够抑制肿瘤发生,影响信号通路,改变炎症反应,在哮喘等过敏性疾病中具有重要作用。亦有研究显示,LncRNA H19与miR-625-5p存在靶向关系[7-8]。但在PU合并HP感染患儿中的相关研究较少,推测LncRNA H19和miR-625-5p可能参与了PU合并HP感染。本研究通过检测PU合并HP感染患儿血清LncRNA H19和miR-625-5p的表达水平,分析对PU合并HP感染的诊断价值,以期为诊断PU合并HP感染提供一定的实验依据。

1 研究对象与方法

1.1研究对象 选取2021年2月至2023年2月在泉州市儿童医院治疗的160例PU患儿,年龄范围为5～14岁。根据是否合并HP感染分为HP阳性组90例,阴性组70例。阳性组男性46例,女性44例,年龄(10.50±2.60)岁;阴性组男性37例,女性33例,年龄(11.20±2.70)岁;收集同期体检健康儿童160例作为健康人对照组,其中男性80例,女性80例,年龄(10.80±2.65)岁,各组性别、年龄之间差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准:(1)患者符合PU相关诊断标准[9];(2)经14C-尿素呼气试验检测,判断为HP感染[10];(3)未使用抑酸剂、抗生素和胃黏膜保护剂等药物治疗;(4)临床资料完整,监护人自愿签署同意书。排除标准:(1)胃食管反流、嗜酸性粒细胞胃肠炎、消化道手术等其他胃肠道疾病;(2)有心、肝、肾等功能障碍或疾病者;(3)免疫系统和血液系统疾病者;(4)存在感染及其他炎性疾病。本研究经患儿及健康儿童监护人知情同意,且经泉州市儿童医院医学伦理委员会批准(伦理文号:2021012611)。

1.2方法

1.2.1样本采集 所有患儿入院后24 h内(健康人对照组为体检当日)采集空腹静脉血3～4 mL,室温静置30 min,以800×g离心10 min进行血清分离,并置于-20 ℃保存待测。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清LncRNA H19和miR-625-5p水平 按照Trizol试剂盒(货号:SH-2366,北京凯诗源生物科技有限公司)说明书对各组样本总RNA进行提取,并采用紫外分光光度法对总RNA浓度和纯度进行评估。按照M-MLV反转录试剂盒(货号:PR2555,北京普非生物科技有限公司)说明书将RNA反转录为cDNA。反转录体系:总RNA 2 μL,RNase Free ddH2O 20 μL,PrimeScript RT Master Mix 4 μL。反转录条件:42 ℃反转录60 min,85 ℃灭活反转录酶5 min。LncRNA H19和miR-625-5p引物及U6、GAPDH内参引物由广州锐博生物公司设计并合成,引物序列见表1。以cDNA为模板,采用qRT-PCR试剂盒(货号:KT201,北京天根生化科技有限公司)检测血清样本中LncRNA H19和miR-625-5p的表达水平。PCR反应体系:0.5 μL cDNA模板,5 μL ddH2O,正、反向引物各0.5 μL,6.5 μL 2×Taq PCR Master Mix。反应条件:95 ℃预变性15 min;95 ℃变性15 s,65 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共40个循环。所有样本重复3次。LncRNA H19以GAPDH为内参照,miR-625-5p以U6为内参照,使用2-ΔΔCt法计算二者的相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3HP感染分型检测 利用HP抗体分型检测试剂盒(货号:YDLC-693,上海羽哚生物科技有限公司)检测患者HP抗体类型,具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。结果判读:(1)细胞毒素相关蛋白(CagA)、空泡毒素相关蛋白(VacA)区带中任意一种或两种同时出现,为Ⅰ型HP抗体阳性;(2)未见CagA和(或)VacA区带,为Ⅱ型HP抗体阳性;其中HP感染Ⅰ型68例,HP感染Ⅱ型22例。

2 结果

2.1健康人对照组、HP阴性组、阳性组PU患儿血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比较 与健康人对照组相比,HP阴性组、阳性组PU患儿血清LncRNA H19水平显著升高(P<0.05),miR-625-5p水平显著降低(P<0.05);阳性组较阴性组血清LncRNA H19水平升高更为明显(P<0.05),而miR-625-5p水平降低更为显著(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比较

2.2不同分型HP感染PU患儿血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比较 HP感染Ⅰ型、HP感染Ⅱ型患儿血清LncRNA H19水平分别为(1.84±0.24)和(1.63±0.20),miR-625-5p水平分别为(0.50±0.07)和(0.62±0.11)。与HP感染Ⅰ型相比,HP感染Ⅱ型PU患儿血清LncRNA H19水平显著降低(t=3.705,P<0.05),miR-625-5p水平显著升高(t=6.014,P<0.05)。

2.3PU合并HP感染患儿血清LncRNA H19和miR-625-5p水平的相关性 采用生物信息学在线网络工具Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析预测LncRNA H19与miR-625-5p间存在结合位点(图1)。Pearson相关性分析显示,PU合并HP感染患儿血清LncRNA H19与miR-625-5p水平呈显著负相关(r=-0.536,P<0.05)。

图1 LncRNA H19与miR-625-5p间的结合位点

2.4Logistic回归分析LncRNA H19、miR-625-5p与PU患儿HP感染的关联 以PU患儿HP感染情况为因变量,LncRNA H19、miR-625-5p为自变量进行Logistic回归分析,结果发现,LncRNA H19是影响PU患儿HP感染的危险因素(P<0.05),miR-625-5p是其保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 Logistic回归分析LncRNA H19、miR-625-5p与PU患儿HP感染的关联

2.5LncRNA H19、miR-625-5p水平对PU患儿HP感染的诊断价值 ROC曲线显示,LncRNA H19、miR-625-5p单独及二者联合诊断PU患儿HP感染的AUCROC分别为0.870、0.895和0.935,二者联合均优于其各自单独诊断(Z二者联合-LncRNA H19=1.991,P=0.023;Z二者联合-miR-625-5p=1.707,P=0.044)。见表4和图2。

图2 LncRNA H19、miR-625-5p水平诊断PU患儿HP感染的ROC曲线

3 讨论

PU具有慢性和复发性,临床主要表现为上腹部疼痛、烧心、反酸,及时诊断和治疗可最大限度地降低PU相关发病率和死亡率[11-12]。研究发现,HP感染引发PU,介导免疫炎症发生以及炎症细胞因子的释放,其可致强烈而复杂的宿主免疫反应,但不足以消除病原体,造成胃黏膜破环,屏障功能损伤,严重者可能会发生出血、穿孔等并发症,严重威胁患者的生命健康[13-15]。因此,寻找有助于诊断PU合并HP感染的因子,可以及时加以干预,以便在临床诊疗中对患儿进行及时的治疗。

LncRNA H19是一种参与发育调节的RNA,其通过影响HP感染相关信号,传导介质促进PU以及上皮屏障功能受损[16-17]。Mohamed等[18]研究发现,HP感染相关的胃溃疡患者LncRNA H19水平升高,对HP引起的PU的诊断具有较高的准确性、特异性和敏感性。Zhang等[6]研究发现,LncRNA H19在HP感染的胃癌组织和细胞中表达上调,过表达LncRNA H19通过增强NF-κB诱导的炎症,促进HP感染诱导的胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-625-5p作为miRNA的一种,能够抑制NF-κB信号传导,表现出抗炎作用[19]。黄岚等[20]研究发现,上调miR-625-5p水平可调控STAT3,减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡和炎症反应。Qian等[21]研究发现,人类支气管上皮细胞中miR-625-5p升高可减少IL-6和TNF-α的分泌,抑制哮喘气道炎症。本研究发现,与健康人对照组相比,HP阴性组、阳性组PU患儿血清LncRNA H19水平依次显著升高,miR-625-5p水平依次显著降低。提示LncRNA H19、miR-625-5p与PU患儿HP感染具有一定的相关性。研究显示,HP可分为Ⅰ型菌株[细胞毒素A(CagA)和(或)空泡毒素A(VacA)阳性]与Ⅱ型菌株(CagA和VacA阴性),前者具有较强致病性,为PU的主要致病菌株[22-24]。VacA菌株使胃黏膜细胞发生空泡样变性,导致细胞间的紧密连接松弛,削弱胃黏膜的屏障功能,导致黏膜萎缩、糜烂、溃疡。CagA菌株可刺激炎性因子产生,引起胃黏膜中性粒细胞浸润,损伤胃黏膜,促进PU的产生。本研究结果显示,HP Ⅰ型菌株感染数高于Ⅱ型;与Ⅰ型菌株相比,Ⅱ型患儿血清LncRNA H19水平明显降低,miR-625-5p水平明显升高,说明LncRNA H19、miR-625-5p水平与PU患儿HP感染分型存在相关性,二者可用于分析PU患儿HP感染分型情况。

本研究还发现,使用Starbase工具预测LncRNA H19与miR-625-5p间存在结合位点,且PU合并HP感染患儿血清LncRNA H19与miR-625-5p水平呈负相关。提示LncRNA H19与miR-625-5p之间具有相互作用,可影响患儿HP感染情况,与既往研究相一致[8]。Logistic回归分析发现,LncRNA H19是影响PU患儿HP感染的危险因素,miR-625-5p则是保护因素,提示二者可作为评估PU患儿HP感染的生物学标志物,并可能作为临床靶向治疗PU患儿HP感染的靶点。笔者推测高水平的LncRNA H19通过负调控miR-625-5p,增强NF-κB诱导的炎症,破坏上皮屏障功能,促进HP感染。经ROC曲线分析,LncRNA H19、miR-625-5p二者联合诊断PU患儿HP感染的AUCROC为0.935,均优于其各自单独诊断,提示二者联合对PU合并HP感染具有一定的诊断价值,临床医师可通过比较治疗前后患儿LncRNA H19、miR-625-5p水平评估疗效,对不接受胃镜复查患儿有一定的临床应用价值。

综上所述,PU合并HP感染患儿血清LncRNA H19水平升高,miR-625-5p水平降低,对PU合并HP感染具有一定的诊断价值。然而,仍需大量样本对LncRNA H19和miR-625-5p在PU合并HP感染患儿中的临床意义进行进一步验证,并需要通过细胞和动物实验以及通过基因敲除或过表达方法进一步探究二者在PU合并HP感染中的作用机制,为二者在临床应用中提供更充分的实验依据。