基于数据挖掘和网络药理学探讨中药治疗肌肉萎缩的用药规律和作用机制

陆 哲,欧 莉,张萌萌,李 瑶,谢硕男,康文倩,张依娜,王 欣

(陕西中医药大学药学院临床中药学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:23127438@qq.com)

肌肉萎缩是一种进行性骨骼肌细胞退化疾病[1],当蛋白质合成与降解不平衡时就会发生肌肉萎缩[2],临床表现为肌肉体积减少、力量缺失及功能下降,它是骨伤科的常见并发症,也继发于脓毒症、癌症、心力衰竭等疾病[3,4]。肌肉萎缩在中医中归属于“痿证”,《素问·痿论》中提出了“治痿独取阳明”的治法[5],阳明经是多气多血之经,脾与胃互为表里,皆位于中焦,与阳明经联系紧密,其中胃主受纳,脾主运化,脾又为“后天之本”“气血生化之源”,只有脾运化正常,能够化生气血阴阳并旁达四周,才能充养肢体筋脉,有助于痿病的恢复。本研究收集整理了治疗肌肉萎缩的相关方药,基于中医传承辅助平台分析其用药规律,通过网络药理学探究核心药对治疗肌肉萎缩的作用机制,并通过分子对接验证结果,以期为临床中医药治疗肌肉萎缩提供配伍参考,且为后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 数据挖掘

1.1.1 资料来源及筛选 以“中药”“肌肉萎缩”“痿证”等为关键词,检索中国知网(CNKI)2012年1月1日至2022年12月31日与肌肉萎缩相关的文献,收集中药处方完整、剂量明确、遵循中医辨证思想、有明确疗效的文献。同时收集《中医方剂大辞典》中“主治”或“功用”项下明确记载“肢体软弱无力”“肌肉松弛”“萎缩”等症状的方剂。通过筛选合并,共获得182首治疗肌肉萎缩的方剂。

1.1.2 药名规范化 根据2020版《中国药典》[6]对中药名称进行统一规范。例如将“薄桂”“桂心”统一为“肉桂”,“元胡”统一为“延胡索”,“破故纸”统一为“补骨脂”等。

1.1.3 数据录入及分析 在中医传承辅助平台(V2.5)软件“平台管理”项下的“方剂管理”中依次录入已收集的182首方剂,由双人对录入数据进行审核,确保信息的准确性。而后在该软件“数据分析”中进行药物频数统计及关联分析,获得核心药对。

1.2 网络药理学

1.2.1 核心药对活性成分及相应靶点筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)中检索核心药对的所有化学成分,将口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为筛选标准,进一步筛选符合标准的活性成分。在TCMSP和Swiss Target Prediction数据库中获取活性成分对应靶点。

1.2.2 疾病相关靶点筛选及药物-疾病交集靶点获取 在OMIM、GeneCards和TTD数据库中以“muscle atrophy”为关键词检索疾病靶点,利用在线韦恩分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)获取药物活性成分靶点与疾病靶点的交集,得到的靶点即为核心药对治疗肌肉萎缩的作用靶点,利用Cytoscape 3.9.1软件构建核心药对治疗肌肉萎缩活性成分与潜在作用靶点网络图。

1.2.3 数据分析 ①在STRING 11.5数据库中进行交集靶点的PPI分析,然后使用Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络图,经过软件内置的插件进行网络拓扑分析,得出核心靶点;②在Metascape数据库里完成交集靶点的GO及KEGG富集分析,设定P<0.01,并将相关结果利用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn)以柱状图和气泡图的形式输出;③分子对接:在PDB数据库下载关键靶点的蛋白质结构,蛋白的去水、去配体等操作在PyMOL软件完成,在Pubchem数据库下载化合物的3D结构,蛋白受体和小分子配体的常规处理在AutoDockTools 1.5.7里进行,将结果输出为pdbqt格式文件,利用AutoDock 4.2.6对蛋白受体与配体进行分子对接操作并获取二者的结合能,部分结果在PyMOL软件中进行可视化处理。方法步骤参考文献[7,8]。

2 结果

2.1 数据挖掘结果

2.1.1 药物频数分析结果 治疗肌肉萎缩的182首方剂共应用201味中药,其中排列在前20味的中药分别为补虚药(黄芪、熟地黄、当归、白术、人参、甘草、山药、白芍、麦冬、肉苁蓉、石斛)、活血化瘀药(牛膝、川芎)、利水渗湿药(茯苓)、温里药(肉桂、附子)、理气药(陈皮)、清热药(黄柏)、收涩药(五味子、山茱萸)。按照频次降序排列,见表1。

表1 排名前20味治疗肌肉萎缩的中药分布

2.1.2 基于关联规则的药物组合分析结果 设置支持个数为40(表示所有药物中同时出现的个数),置信度为0.7,点击“用药模式”,将支持度排名前10的药对展示,结果见表2,其中人参-黄芪组合支持度最高,黄芪-熟地黄次之,结合药物频数分析结果,选择黄芪-熟地黄作为核心药对进行网络药理学分析。

2.2 网络药理学结果

2.2.1 核心药对活性成分和靶点的获取 通过检索TCMSP数据库筛选共得到19个活性成分,其中黄芪17个,熟地黄2个,具体信息见表3。从TCMSP和Swiss Target Prediction数据库中获得相应靶点,最终获得黄芪-熟地黄药对相关靶点319个。

表3 黄芪-熟地黄活性成分

2.2.2 核心药对治疗肌肉萎缩活性成分-作用靶点网络的构建 通过检索OMIM、GeneCards和TTD数据库,筛选得到1 799个与肌肉萎缩相关的靶点,与药物靶点交集后得到86个共同靶点。核心药对治疗肌肉萎缩活性成分-作用靶点网络图利用Cytoscape软件构建。该网络共有102个节点,196条边(见图1)。网络拓扑分析显示,度值排名前三的成分分别是槲皮素(MOL000098)、山奈酚(MOL000422)和豆甾醇(MOL000449),说明这3种成分可能在治疗肌肉萎缩中起到关键作用。

黄色三角形代表黄芪的活性成分,蓝色三角形代表熟地黄的活性成分,绿色菱形代表作用靶点,每条边代表节点与节点之间相互作用的关系

2.2.3 PPI网络及关键靶点分析 黄芪-熟地黄药对与肌肉萎缩交集靶点的PPI网络共有85个节点,1 418条边(见图2)。图中圆形分别代表85个交集靶点,网络拓扑分析得到的中间中心性平均值为56.329,接近中心性平均值为0.619,度值平均值为33.365。其中度值较高的靶点有AKT1、TNF、IL-6等,说明这些靶点在黄芪-熟地黄药对治疗肌肉萎缩的作用机制中发挥了相对重要的作用。

圆形面积越大、颜色越深,表示该节点度值越大,在网络中越重要。图中每条边代表各节点相互作用的关系,其中线条颜色越深,代表相互作用的关系越紧密

2.2.4 GO及KEGG富集分析 GO富集分析共得到1 616条生物过程(biological process,BP),90条细胞组成(cellular component,CC),117条分子功能(molecular function,MF),将部分条目可视化,结果见图3。BP主要包括对无机物质的反应、对氧气水平的反应、磷酸化的正调节、细胞迁移的正调节等;CC主要包括膜筏、膜微区和囊泡腔等;MF主要包括转录因子结合、激酶调节活性和信号受体活化剂活性等。

图3 黄芪-熟地黄治疗肌肉萎缩的GO富集分析

KEGG通路富集分析共得到176条通路,将部分通路进行可视化(P值排名前20),结果发现,主要包括癌症通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路等(见图4)。

气泡面积越大,颜色越深,代表基因靶点在该通路富集程度越高

2.2.5 分子对接结果 选取度值排名前三的成分及PPI排名前三的靶点使用AutoDock软件进行分子对接,结果显示,核心成分和关键靶点的结合能均小于-5 kJ/mol(见表4),说明二者有较好的蛋白结合活性。将部分对接结果进行可视化,结果见图5。

图5 核心成分与关键靶点分子对接三维结构图

表4 核心成分与关键靶点结合能 (kJ/mol)

3 讨论

本研究收集整理了近10年中国知网以及《中医方剂大辞典》中治疗肌肉萎缩的方剂,利用中医传承辅助平台进行数据分析,结果显示补虚药应用最多,活血化瘀药次之,符合中医治疗肌肉萎缩的用药原则,根据药物频数分析和关联分析得出黄芪-熟地黄为治疗肌肉萎缩的核心药对。黄芪和熟地黄配伍能补气养阴生血。现代药理研究表明,黄芪具有增强免疫力、保护内脏、调节血压和抗肿瘤等作用[9,10],并能改善废用性大鼠骨骼肌萎缩[11]。熟地黄具有提高免疫力、促进造血、抗氧化、影响骨代谢和增强记忆力等作用[12],有研究表明地黄多糖可以显著降低大鼠骨骼肌中FOXO1、MAFbx和MuRF1 mRNA的表达水平[13]。同时,二药配伍作为基础方治疗肌肉萎缩也有较好的疗效。研究显示补肾健脾活血方对悬尾大鼠骨丢失和肌肉萎缩具有改善作用[14]。此外,补肾健脾方还能有效抑制蛋白质分解代谢,延缓糖皮质激素诱导的骨骼肌萎缩[15]。

通过网络药理学对黄芪-熟地黄药对进行分析,得出槲皮素、山奈酚、豆甾醇等可能是治疗肌肉萎缩的核心成分。槲皮素是黄酮类化合物,研究表明槲皮素通过调节Bax/Bcl-2蛋白表达和逆转线粒体膜电位(ΔΨm)失衡保护地塞米松诱导的肌肉萎缩,从而抑制细胞凋亡[16]。此外,槲皮素还可以通过上调HO-1,从而减少在肥胖条件下TNF-α诱导的肌肉萎缩[17]。研究表明山奈酚通过抑制NOX活化,发挥胞质中的抗氧化作用,减少ROS生成,从而完成对细胞的保护作用[18]。豆甾醇是一种天然存在的类固醇,研究显示豆甾醇通过SREBF2减少IL-1β诱导的软骨细胞损伤中的细胞损伤[19]。

通过PPI网络拓扑分析得出AKT1、TNF、IL-6等可能是黄芪-熟地黄药对治疗肌肉萎缩的重要靶点。AKT1是AKT基因家族的一员,对于骨骼肌质量和功能的调节非常重要,有研究表明缺乏AKT1的小鼠肌肉质量和收缩力都会降低[20]。TNF家族包括TNF-α和TNF-β,其中TNF-α是一种多向性的促炎性细胞因子,研究表明高水平的TNF-α会导致蛋白质合成减慢及蛋白质分解加快,其结果是骨骼肌萎缩[21]。此外,TNF-α还可通过激活转录因子NF-κB家族,从而抑制骨骼肌再生与修复[21]。IL-6能促进蛋白质降解并抑制胰岛素信号传导,这可能会减少肌肉蛋白质合成,从而减少蛋白质稳态[22]。

KEGG通路富集结果显示,黄芪-熟地黄药治疗肌肉萎缩主要与PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路和癌症通路有关。PI3K-Akt信号通路主要参与细胞增殖、分化等,研究显示P13K-Akt信号通路活性降低,可导致肌肉萎缩[23]。IGF-1是一种促进体内蛋白质合成的重要因子,当发生肌肉萎缩时,IGF-1水平降低,抑制PI3K-Akt通路从而减少成肌相关蛋白合成[24]。FOXO转录因子是PI3K-Akt信号通路的一个下游靶点,当磷酸化时留在细胞质中,去磷酸化后可进入细胞核中发挥转录作用[23]。AKT是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,被激动后通过磷酸化可以抑制FOXO转录因子家族的核转位,从而促进蛋白质合成来阻止肌肉萎缩诱导的Atrogin-1和MURF1等相关基因的表达[25,26]。HIF-1α是一种缺氧诱导因子,主要参与氧转运、代谢适应、新血管形成和各种细胞功能[27]。已有研究表明,HIF-1α在肌肉减少症中起作用,并参与肌卫星细胞稳态[28]。此外,有研究阐释了一种新的肌肉萎缩机制,当发生肌肉损伤时,HIF-1α被激活使铁转运蛋白表达升高,受伤肌肉中铁浓度降低,导致肌细胞丢失和线粒体膜电位明显耗竭,从而导致肌肉萎缩[29]。最后,癌症通路虽然富集程度最高,但它与肌肉萎缩的相关性缺乏研究支持。

分子对接结果显示,黄芪-熟地黄核心成分与关键靶点的结合能均小于-5 kJ/mol,提示二者之间具有较强的结合能力。

综上所述,本研究通过数据挖掘探究中药治疗肌肉萎缩的用药规律,运用网络药理学的方法分析得出核心药对的有效成分槲皮素、山奈酚、豆甾醇可能通过PI3K-Akt、HIF-1等信号通路调控AKT1、TNF、IL-6等基因靶点对肌肉萎缩起到治疗作用。本研究揭示了黄芪-熟地黄药对通过多成分、多靶点、多通路干预治疗肌肉萎缩的可能的作用机制,并且经过分子对接技术得以初步验证,但仍需进一步通过体内外实验来加以验证。