基于网络药理学和分子对接探讨护骨胶囊治疗骨质疏松症的作用机制

周俏苑，陈洪，刘海全*，黄桂琼，秦佳佳

1.广州中医药大学惠州医院（惠州市中医医院），广东 惠州 516000

2.暨南大学，广东 广州 510000

骨质疏松症是一种骨骼系统疾病，其特征是骨量低和骨微结构改变，致骨折风险增加。经典理论认为，骨质疏松症本质上是由雌激素缺乏/衰老（原发性骨质疏松症）或继发于疾病/药物（继发性骨质疏松症）引起的骨重塑障碍[1]。骨质疏松症已被定义为21 世纪的无声疾病，由于其严重性、慢性和进展性而成为一种公共卫生风险，主要影响绝经后妇女和老年人[2]。调查发现，我国65 岁以上人群中，骨质疏松症患病率为32.0%，其中女性为51.6%，男性为10.7%[3]。骨质疏松症在临床上主要表现为腰背部疼痛或全身骨痛，甚至脊柱变形及骨折。骨质疏松症在中医学上总属于“骨痿”或“骨痹”或“腰痛”等范畴，其病机根本为肝脾肾三脏虚损，因虚致瘀，进而导致骨骼失养[4]。临床上治疗总以补肾活血为主[5]。

护骨胶囊是在“肾主骨生髓”和“补肾生髓”的理论基础上，由淫羊藿、制何首乌、熟地黄、龟甲、巴戟天、杜仲、续断、骨碎补、当归和山药组合而成，主要具有补肾益精、养血活血的功效[6]。临床研究表明，护骨胶囊可有效缓解症状、改善骨代谢、提高骨密度等，且安全性良好[7-9]。护骨胶囊适用于骨质疏松症患者，但护骨胶囊治疗骨质疏松症的活性物质及作用机制尚不明确。因此，本研究结合网络药理学和分子对接技术探究护骨胶囊治疗骨质疏松症的物质基础和分子机制，旨在为进一步研究护骨胶囊治疗骨质疏松症的实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 护骨胶囊化学成分收集

本研究在中药系统药理学分析平台TCMSP 数据库检索护骨胶囊处方中的各个单味药的活性成分，筛选标准：生物利用度（OB）≥30%，类药性指数（DL）≥0.18，相对分子质量（MW）＜500，氢键供体数目（Hdon）≤5，氢键受体数目（Hacc）≤10 和脂水分配系数（lgP）≤5。由于存在某些中药有效成分不满足筛选条件在本数据库容易被剔除和其他非特征性且无效成分被纳入候选的客观因素，故结合《中国药典》2020 版进行筛选候选活性成分，最后通过文献检索和综合考虑对筛选出的单味药活性成分进行补充和剔除。

1.2 护骨胶囊化学成分潜在靶点预测

根据筛选出来的化合物在PubChem 数据库中查找其Canonical SMILES 结构，将其上传至Swis Target Prediction、Pharmmapper 等数据库获取靶点信息，并通过UniProt 数据库为靶基因注释及确认，合并去重后得到护骨胶囊化学成分靶点。

1.3 骨质疏松症相关靶点筛选

以“osteoporosis”为关键词，在Drugbank、TTD、Genecards、DisGeNET 等数据库收集骨质疏松症相关靶点，取其交集作为骨质疏松症疾病靶点。

1.4 护骨胶囊治疗骨质疏松症相关靶点及关联网络构建

将收集的护骨胶囊化学成分潜在靶点和骨质疏松症疾病靶点上传至在线做图软件Venny 2.1.0获取其交集靶点作为护骨胶囊治疗骨质疏松症的潜在靶点。将护骨胶囊化学成分和护骨胶囊治疗骨质疏松症的交集靶点导入Cytoscape 3.9.0 软件，构建成分靶点网络图。并进行网络拓扑分析，筛选主要化学成分。在网络中，以节点度（degree）和介值中心度（between nesscentrality）来反映节点的重要程度，节点代表化合物信息，边代表活性成分-靶点的相互作用。

1.5 蛋白相互作用（PPI）网络图的构建

将潜在靶点导入String 数据库获取蛋白互作信息，将信息导入Cytoscape 3.9.0 软件绘制PPI 网络图；运用其插件“NetworkAnalyzer”对PPI 网络图进行分析，并将节点（node）大小和颜色设置用于反映degree 值的大小。

1.6 基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

将潜在靶点导入DAVID 数据库进行GO 和KEGG 富集分析，以P＜0.05 为筛选条件，分析潜在靶点聚类于护骨胶囊治疗骨质疏松症相关的生物学过程或信号通路，将富集结果可视化处理。

1.7 分子对接

从PubChem数据库获取活性成分的SDF格式，再导入Chemdraw 3D 软件进行结构优化，得到活性成分分子结构mol2 格式。从PDB 数据库下载目标靶点基因 PDB 格式的 3D 分子结构。利用AutoDockTools 1.5.6 软件进行分子对接，最后将分子对接结果导入Pymol 软件进行可视化分析。

2 结果

2.1 护骨胶囊化学成分

通过TCMSP 数据库和文献检索筛选护骨胶囊有效成分，共收集了59 个化学成分，其中淫羊藿12 个、制何首乌5 个、熟地黄5 个、龟甲5 个、巴戟天6 个、杜仲6 个、续断5 个、骨碎补5 个、当归5 个、山药5 个，见表1。

表1 护骨胶囊活性成分信息Table 1 Information of active ingredients of Hugu Capsules

2.2 护骨胶囊活性成分潜在靶点预测

将筛选出的活性成分的SMILE 格式文件导入到Swiss Target Prediction 等数据库进行潜在靶点预测，共得到529 个潜在靶点。

2.3 骨质疏松症相关靶标

通过检索GeneCard、DrugBank、OMIM 等数据库共获得与骨质疏松症相关的疾病靶点共1 609个，与2.2 项下预测的潜在靶点构建韦恩图，最终获得护骨胶囊可能治疗骨质疏松症的相关靶点共78 个，见图1。

图1 护骨胶囊潜在靶点与骨质疏松症靶标韦恩图Fig.1 Venn diagram of Hugu Capsules potential targets and osteoporosis targets

2.4 护骨胶囊活性成分网络构建和分析

将交集靶点及其对应的成分信息导入Cytoscape 3.9.0 软件，构建“中药-成分-靶点”网络图（图2），同时进行网络拓扑分析，筛选主要化学成分，选择degree 排名前12 位的活性成分作为核心化学成分，见表2。

图2 中药-成分-靶点网络图Fig.2 Traditional Chinese medicine-component-target network diagram

表2 护骨胶囊主要活性成分Table 2 Main active ingredients in Hugu Capsules

2.5 基于String 和Cytoscape 软件的PPI 网络构建和分析

将78 个交集靶点上传至String 数据库，运行得到PPI 数据。将结果导入到Cytoscape 3.9.0 软件绘制靶点互作网络，通过Cytoscape 3.9.0 软件中的Network Analyzer 功能进行网络拓扑学分析，绘制核心靶点PPI 网络图，见图3。颜色深浅和大小表示该节点在网络中的重要程度。选取排名前5 位靶点作为核心靶点，即肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、酪氨酸蛋白激酶3（MAPK3）、雌激素受体α（ESR1），其中TNF 可能是治疗骨质疏松症关键靶点，见表3。

图3 PPI 网络图Fig.3 PPI network diagram

表3 主要核心靶点蛋白Table 3 Main core target proteins

2.6 GO 功能富集与KEGG 通路富集分析

2.6.1 GO 功能富集分析 采用DAVID 数据库对交集靶点进行GO 富集分析。研究结果显示，置信度P＜0.05 的生物学过程（BP）有917 条，分子功能（MF）有98 条，细胞组成（CC）相关路径33条。护骨胶囊可能通过参与众多过程治疗骨质疏松症，主要包含对有机物的响应、对含氧化合物的响应和对化学的响应等；MF 涉及核受体活性和过渡金属离子结合、类固醇结合等多个过程；CC 包括细胞外空间、质膜和宿主细胞核等。分别选取前10 条富集结果进行可视化分析（图4）。

图4 交集靶点GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of intersection targets

2.6.2 KEGG 通路分析 KEGG 通路富集到P＜0.05 相关通路共159 条，选择排名前20 条信号通路进行可视化分析。主要富集通路有糖尿病并发症中的晚期糖基化终末化产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、松弛素信号通路、雌激素信号通路、Rap1 信号通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、MAPK 信号通路、癌症途径、流体剪切力与动脉粥样硬化等，表明护骨胶囊可能通过多个通路治疗骨质疏松症。以上结果选取前20条信号通路，绘制气泡图，见图5。

图5 KEGG 通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG pathway

2.7 分子对接验证

将排名前5 位的核心靶点TNF、VEGFA、SRC、MAPK3、ESR1 与排名前5 位的活性成分地黄苦苷元、大黄素甲醚、甲基异茜草素、阿魏酸、大豆苷元进行分子对接，并记录两者亲和力数值，亲和力数值小于-5 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），认为小分子与蛋白的结合能力较强，结果见热图（图6）。其中大黄素甲醚与MAPK3 结合能最低，为-7.16 kcal/mol，两者之间存在氢键作用力及疏水作用力。以Physcion 和MAPK3 对接为例，借助Pymol 软件进行可视化分析（图7）。

图7 大黄素甲醚-MAPK3 对接图Fig.7 Physcion-MAPK3 interconnection diagram

3 讨论

本研究基于网络药理学的研究策略[10]，对护骨胶囊治疗骨质疏松症的潜在活性成分、靶点和作用机制进行探究，最后借助分子对接对小分子和蛋白质之间的相互作用进行验证。本研究通过TCMSP数据库结合《中国药典》2020 版及文献检索收集的护骨胶囊化学成分，进一步构建“成分-交集靶点”网络，网络拓扑分析发现地黄苦苷元、大黄素甲醚、甲基异茜草素、阿魏酸、大豆苷元、松果菊苷等核心化合物可能是护骨胶囊治疗骨质疏松症的核心成分。Liu 等[11]研究证实了地黄苦苷元具有抗炎作用。Hou 等[12]研究发现阿魏酸可通过激活糖皮质激素诱导的骨质疏松症新生鼠体内的沉默调节蛋白1（SIRT1）和核因子-κB（NF-κB）来预防骨质疏松症。在动物模型和培养细胞中，已观察到大豆苷元具有促进骨形成和防止骨吸收的雌激素样作用[13]。大黄素甲醚属于属蒽醌类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌和抗诱变等作用[14-15]。Jiang 等[16]研究发现松果菊苷在体外通过阻止活化T-细胞核因子1（NFATc1）易位、下调其表达和影响磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/原癌基因c-Fos 通路来抑制破骨细胞分化、F-肌动蛋白带形成、骨吸收功能和破骨细胞特异性基因表达，松果菊苷还通过抑制破骨细胞活性减轻体内假体周围感染（PJI）诱导的骨溶解并维持骨量。动物实验研究发现，甲基异茜草素可抑制破骨细胞的形成与分化并降低破骨细胞的吸收[17]。胡倩影等[18]通过动物实验证实了杜仲中的松脂素可通过促进成骨细胞的增殖与分化，以达抗骨质疏松的作用。雌二醇（E2）是通过促进成骨细胞增殖和分化来治疗骨质疏松症的一线药物，而松脂素对成骨细胞的增殖和分化具有与E2类似作用[19]。现代药理学研究发现，藁本内酯具有抗炎、镇痛、抗氧化等作用，对骨质疏松、骨关节炎、心脑血管等疾病也有治疗作用[20]。实验证明，藁本内酯可通过抑制破骨细胞的形成与分化，从而达到骨保护作用[21]；藁本内酯显著抑制一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生，并通过阻断MAPKs/IκB 激酶（IKK）和下游转录因子AP-1 和NF-κB 的激活从而表现出抗炎活性[22]。楼棪[23]通过实验研究发现，海风藤酮可直接抑制Rank1 所诱导的破骨细胞的形成。尿囊素可促进MAPK 磷酸化、增加葡萄糖的摄取等过程，达到预防骨骼肌功能障碍的作用[24]。综上所述，护骨胶囊通过抗炎、抑制破骨细胞的形成与分化与促进成骨细胞的增值与分化，达到治疗骨质疏松症的潜在治疗作用。

PPI 网络分析表明，TNF、VEGFA、SRC、MAPK3、ESR1 可能是护骨胶囊治疗骨质疏松症的关键靶点。TNF-α 调节成骨细胞和破骨细胞的分化功能是通过肿瘤坏死因子表面受体1（TNFR1）和表面受体2（TNFR2）实现的。动物实验研究证实，TNF-α 信号会促进正常小鼠和TNFR1 缺失小鼠细胞的骨形成，而TNFR2 只有在骨损伤时调节TNFα 在骨折愈合中的再生效应[25]。研究报道，来自早期成骨细胞（Osx+）的VEGFA 在骨损伤时对于骨膜快速血管生成和骨折修复过程中的编织骨形成至关重要[26]。实验研究发现，SRC SH2 选择性结合化合物可降低破骨细胞吸收活性[27]。MAPK3 可通过影响PI3K/Akt 通路治疗骨质疏松[28]。ESR1 与绝经后妇女骨质疏松关系密切[29-30]；同时，B 细胞中一种新的ESR1 和MAPK3 网络被认为是绝经后骨质疏松症的病因[31]。ESR1 和MAPK3 均参与雌激素受体信号和细胞外信号调节激酶（ERK）/MAPK信号通路。

GO 和KEGG 富集分析表明，护骨胶囊主要通过细胞外空间、质膜、宿主细胞核等CC 参与细胞生存、生长、分裂等众多BP，继而与蛋白质特异性结合，发挥调节核受体活性、过渡金属离子结合、类固醇结合等MF，涉及糖尿病并发症中的糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、松弛素信号通路、雌激素信号通路、Rap1 信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路等，表明护骨胶囊可能通过多个通路作用于多个靶点发挥治疗骨质疏松症的作用。Cheng 等[32]研究发现，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂促进肥胖2 型糖尿病大鼠成骨细胞生成并抑制骨吸收，作用机制可能部分是由AGEs/RAGE/活性氧（ROS）通路通过与GLP-1 受体相互作用介导的。松弛素是一种肽激素，通过激活胶原酶来改变软骨和肌腱的特性，还参与骨骼重塑和受伤韧带和骨骼肌的愈合[33]。雌激素是女性和男性骨代谢的主要激素调节剂，对骨细胞、破骨细胞和成骨细胞的直接作用分别导致骨重塑抑制、骨吸收减少和骨形成维持，还调节破骨细胞的成骨细胞/骨细胞和T 细胞调节[34]。微小RNA（miRNA）广泛调节骨的正常生物学功能以及骨折愈合和骨质疏松的进展[35]。其中，miRNA-182 在调节细胞的凋亡、生长和分化中发挥重要作用，Pan 等[36]研究表明，下调的miR-182-5p 通过上调腺苷酸环化酶异构体6 的Rap1/MAPK 信号通路激活，促进骨质疏松症大鼠成骨细胞的增殖与分化，这可能是治疗骨质疏松症的新靶标。缺氧刺激可调节骨的形成、维持和修复[37]，缺氧也是调节血管生成-成骨耦合过程的主要驱动力，HIF-1α 为HIF-1 的活性亚基，研究结果表明，缺氧可以通过 HIF-1α 途径上调VEGF，从而改善血管生成以及成骨细胞的分化和活性；HIF-1α 的过度表达显著增加了成骨细胞中的2 种促血管生成因子白细胞介素（IL）-6 和IL-8 的水平，可促进人成骨细胞的增殖[38]。

分子对接结果表明，地黄苦苷元、大黄素甲醚、甲基异茜草素、阿魏酸、大豆苷元核心成分与TNF、VEGFA、SRC、MAPK3、ESR1 核心靶点均具有良好的结合能力，结合能表明它们是护骨胶囊治疗骨质疏松症的关键活性成分。

综上所述，护骨胶囊中的地黄苦苷元、大黄素甲醚、甲基异茜草素、阿魏酸、大豆苷元、松果菊苷可能是治疗骨质疏松症的物质基础，能够作用于TNF、VEGFA、SRC、MAPK3 等多个靶点，通过调节糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、松弛素信号通路、雌激素信号通路、Rap1 信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路等参与骨骼重塑、抑制破骨细胞的形成与分化、促进成骨细胞的增殖与分化和抗炎功能，发挥治疗骨质疏松症的作用。

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