消痔丸对醋酸致肛门溃疡模型大鼠的作用机制研究

李新，华永晨，王春芳,，黄泽森,，韩彦琪，赵专友，许浚，刘永姝,，郝泉，姚鹏飞，张铁军*，柴国林*

1.天津药物研究院 天津市中药质量标志物重点实验室，天津 300462

2.天津药物研究院 中药现代制剂与质量控制技术国家地方联合工程实验室 释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津 300462

3.天津药物研究院 药物成药性评价与系统转化全国重点实验室，天津 300462

4.兰州佛慈制药股份有限公司，甘肃 兰州 730000

5.天津中医药大学，天津 301617

痔疮是一种非常普通的临床上常见的肛肠疾病，发病率较高，因其随时可以发作，严重影响人们的生活与健康。痔疮的病理特征是肛垫病理性肥大、移位及肛周皮下血管丛血流瘀滞形成的局部肿块，痔急性发作常表现为黏膜糜烂、疼痛、便血、红肿、渗出等，并伴有病变部位的感染。研究发现，创伤或炎症性因素可使各种细胞因子表达和活性增强，造成微血管壁及内皮细胞的损伤，不仅导致痔血管生成继续增加，还导致痔出血、水肿、脱出等临床症状，而增大和脱出的痔更易于发生创伤和炎症，从而形成痔发病中的恶性循环[1]。目前临床对早期痔疮主要治疗方法为非手术治疗（如内服、熏洗坐浴、外敷、激光等），从止痛、止血、抑制肿胀、促进溃疡愈合及抗炎等方面着手对痔疮进行有效治疗[2]。

消痔丸出自《疡医大全》，由地榆（炒炭）、牡丹皮、三颗针皮（炒炭）、大黄（酒炒）、黄芪、白及、槐角（蜜炙）、防己、白术（炒）、当归（酒炒）、火麻仁（炒黄）及动物大肠12 味中药组成，具有消肿生肌、清热润便、补气固脱、止血、止痛的功效，主要用于痔疾肿痛、便秘出血、脱肛不收及肠风下血、积滞不化等症，主治痔疮。本研究采用醋酸建立大鼠肛门溃疡模型，进一步探讨消痔丸对溃疡愈合、抗炎消肿等方面的影响。

1 材料

1.1 药物和试剂

消痔丸由兰州佛慈制药股份有限公司生产，每100 丸重4 g，批号 210712；柑橘黄酮片由法国施维雅药厂生产，规格500 mg（以总黄酮计），批号2 019224；痔炎消片由马应龙药业集团股份有限公司生产，规格0.53 g/片，批号220411。

冰醋酸（康科德公司，批号210312）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20220806）；大鼠基质金属蛋白酶-9（MMP-9）ELISA 检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，批号2212261）；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 检测试剂盒（美国Immunoway 公司，批号KL04JH4L0322）；大鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA检测试剂盒（美国 R&D Systems 公司，批号900101）；转化生长因子β1（TGFβ1）抗体（Affinity公司，批号20R6523）；诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）抗体（Affinity 公司，批号62Y7896）；血管内皮生长因子A（VEGFA）抗体（Affinity 公司，批号83M8093）；苏木素染色液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZLI-9610）；伊红染色液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZLI-9613）；兔二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号2228G1129）。

1.2 动物

SPF 级SD 大鼠，5～6 周龄，体质量180～200 g，大鼠由北京斯贝福生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2019-0010，饲养在天津天诚新药评价有限公司实验动物屏障系统[合格证SYXK（津）2021-0008]，温度、湿度、换气次数由中央系统自动控制，温度维持在20～26 ℃，相对湿度维持在40%～70%，通风次数为10～15 次/h 全新风，光照为12 h 明、12 h 暗。自由摄食饮水，适应性喂养1 周。实验动物的使用经天津天诚新药评价有限公司实验动物伦理委员会批准（IACUC：No.2022122302）。

1.3 仪器

SpectraMaxM5 酶标仪（美国MolecularDevices公司）；Sorvall ST 8R 高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；WD-2103B 自动洗板机（北京六一生物科技有限公司）；Leica TP-1020 脱水机（徕卡仪器有限公司）；Leica HistoCore MULTICUT病理切片机（徕卡仪器有限公司）；ES500-1 包埋机（金华市华速科技有限公司）；ES500-3H 组织摊片机（金华市华速科技有限公司）；Leica DM750 正置光学显微镜（徕卡仪器有限公司）；ICC50W 成像系统（徕卡仪器有限公司）。

2 方法

2.1 模型制备、分组及给药

取SD 大鼠80 只，除了对照组10 只，其余大鼠采用浸有冰醋酸的6 mm 滤纸片贴敷肛门，滤纸片需紧密接触肛门皮肤及黏膜，每只鼠用3 片滤纸片，每片贴30 s。6 h 后观察溃疡程度并于24 h 后筛选模型成功的大鼠分为模型组、痔炎消片（0.86 g/kg）组、柑橘黄酮片（0.27 g/kg）组和消痔丸（0.81、1.62、3.24 g/kg）组，每组10 只，每天1 次，连续ig 给药10 d。对照组与模型组ig 给予同等体积的0.1% CMC-Na 溶液。

根据临床给药剂量以人体质量70 kg 换算消痔丸大鼠等效剂量，即中剂量1.62 g/kg，据此分别设置临床剂量1/2 与2 倍即低剂量组0.81 g/kg 和3.24 g/kg，同时分别根据阳性药痔炎消片、柑橘黄酮片临床给药剂量换算得出其大鼠给药剂量分别为0.86 g/kg 和0.27 g/kg。将以上药物研磨均匀后以0.1%CMC-Na 溶液充分混悬按照10 mL/kg ig 给药。

2.2 观察及检测指标

2.2.1 肛周形态及肛门溃疡面积 记录造模后（造模当天为0 d）第1、3、7、10 d 各组大鼠肛周溃疡、潮湿、焦瘕、黏液等情况，并采用Image J 软件对溃疡面积进行计算。评定标准按照表1 进行[3-4]。

表1 表观指标分级标准Table 1 Apparent index grading standard

2.2.2 样品制备 末次给药1 h 后，以1%戊巴比妥钠麻醉，肛周脱毛，棉签置入肛门内作为指引，沿肛周环形分离肛门，深置直肠5 mm 处，剪断直肠，移出标本，剔除周围结缔组织，纵剖，用冰冷生理盐水漂洗，滤纸吸干表面水分，将肛周及直肠组织分为2 部分，一部分用于组织因子检测，另一部分组织用于病理学及组化检测。

2.2.3 肛门组织病理学检测 取2.2.2 项下1/3 量肛门直肠组织，放入10%甲醛溶液中固定，经脱水、包埋后切片，石蜡切片经脱蜡至水、苏木素-伊红染色后脱水封片，经显微镜镜检后采集图像进行分级评分：以大鼠肛周组织黏膜上皮和鳞状上皮细胞排列、增生、缺损，间质或黏膜下充血出血水肿，炎性渗出及坏死，炎细胞浸润和结缔组织增生为观察指标，依据病变程度和范围分为5 个等级，正常0 分，轻微1 分，轻度2 分，中度3 分，重度4 分。

2.2.4 肛门组织中MMP-9、TNF-α、IL-6 含量 取-80 ℃冻存的肛门组织适量，加入适量生理盐水匀浆至均匀、无明显组织块后4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，取上清按照试剂盒要求检测MMP-9、TNF-α、IL-6 含量。

2.2.5 肛门组织iNOS、TGF-β1、VEGFA 蛋白表达收集肛门组织，放入10%甲醛溶液中固定，将组织常规脱水、石蜡包埋、切片处理，按照免疫组化试剂盒操作分别以iNOS、TGF-β1、VEGFA 抗体（1∶200）孵育后，经反应增强液、酶标聚合物、DAB 显色、苏木素复染后脱水封片，于显微镜下观察肛门组织中iNOS、TGF-β1、VEGFA 的蛋白表达，iNOS、TGF-β1、VEGFA 蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒。利用Image J 图像分析软件进行半定量分析，每组取3 个样本进行实验，每张片子随机取5 个高倍视野，测量每个视野中蛋白阳性染色区域面积，计算得到阳性染色区域面与总面积比值，即为iNOS、TGFβ1、VEGFA 蛋白相对表达量。

2.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 7 进行数据分析，数据均以表示，组间差异性采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 消痔丸对大鼠肛周溃疡的影响

对照组大鼠肛门回缩，肛内黏膜无损伤，肛周无水肿等异常情况。各组动物贴敷冰醋酸纸片后均出现白色溃疡面、肛周肿胀、黏液分泌增加、潮湿度显著增加等症状，随着时间推移，各组大鼠肛周溃疡会自行愈和，但给药组大鼠溃疡愈合速度明显加快，尤其在造模后第7 d 时与模型组相比，消痔丸表观评分及溃疡面积明显降低（P＜0.05、0.01、0.001），至造模后第10 d 时各给药组在溃疡面积和表观评分的治疗效果非常显著（P＜0.01、0.001），提示各给药组具有明显的抗醋酸诱导的肛门溃疡作用，见表2、3。

表2 消痔丸对大鼠表观指标的影响（，n=10）Table 2 Effects of Xiaozhi Pills on apparent index in rats (,n=10)

表2 消痔丸对大鼠表观指标的影响（，n=10）Table 2 Effects of Xiaozhi Pills on apparent index in rats (,n=10)

与对照组比较：***P＜0.001；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001***P <0.001 vs control group;#P <0.05 ##P <0.01 ###P <0.001 vs model group

表3 消痔丸对大鼠溃疡面积的影响（，n=10）Table 3 Effects of Xiaozhi Pills on ulcer area in rats (,n=10)

表3 消痔丸对大鼠溃疡面积的影响（，n=10）Table 3 Effects of Xiaozhi Pills on ulcer area in rats (,n=10)

与对照组比较：***P＜0.001；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001***P <0.001 vs control group;#P <0.05 ##P <0.01 ###P <0.001 vs model group

3.2 消痔丸对大鼠组织病理的影响

肛门直肠组织的HE 染色病理结果如图1、表4 所示，对照组大鼠肛周组织黏膜上皮和鳞状上皮细胞排列整齐，未见增生及缺损，间质或黏膜下层未见水肿，小血管扩张充血或出血，炎细胞不明显。模型组大鼠肛周黏膜上皮见脱落欠整齐，局部鳞状上皮层增厚，肛周组织黏膜上皮和鳞状上皮间见损伤区，其间上皮组织缺损，大量嗜中性粒细胞浸润并见炎细胞碎片，侵及黏膜下层或深部肌组织，见炎性渗出物及坏死组织，间质或黏膜下水肿，小血管扩张充血，见散在出血。结缔组织增生反应明显，损伤区累及周边组织。与对照组相比，模型组大鼠肛门直肠组织病理学评分显著提高（P＜0.001）。经消痔丸治疗后，大鼠肛周黏膜上皮脱落减少，有的甚至呈现修复完好，局部鳞状上皮层增厚明显减轻，肛周组织黏膜上皮和鳞状上皮见损伤区，其间上皮组织轻度缺损，缺损范围较模型组明显缩小，嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润减少，炎性渗出物，间质或黏膜下水肿和小血管扩张充血程度明显减轻，结缔组织增生也呈现轻中度反应。与模型组相比，消痔丸各给药组病理学评分显著降低（P＜0.05、0.001）。

图1 各组大鼠肛门直肠组织病理结果（HE 染色）Fig.1 Pathological results of anorectal tissue of rats in each group (HE staining)

表4 消痔丸对醋酸诱导大鼠肛门溃疡模型病理形态学损伤评分的影响（，n=3）Table 4 Effects of Xiaozhi Pills on histopathological damage score of acetic acid induced anal ulceration in rats (,n=3)

表4 消痔丸对醋酸诱导大鼠肛门溃疡模型病理形态学损伤评分的影响（，n=3）Table 4 Effects of Xiaozhi Pills on histopathological damage score of acetic acid induced anal ulceration in rats (,n=3)

与对照组比较：***P＜0.001；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01###P＜0.001***P <0.001 vs control group;#P <0.05 ##P <0.01 ###P <0.001 vs model group

3.3 消痔丸对大鼠肛门直肠组织中MMP-9、IL-6、TNF-α 的影响

如表5 所示，与对照组比较，模型组肛门直肠组织中MMP-9、IL-6、TNF-α 含量显著增高（P＜0.001）。与模型组相比，消痔丸以及各给药组均可显著降低肛门组织中的MMP-9、IL-6、TNF-α 含量（P＜0.001）。

表5 消痔丸对醋酸诱导大鼠肛门溃疡模型肛门直肠组织中MMP-9、IL-6、TNF-α 含量的影响（，n=10）Table 5 Effects of Xiaozhi Pills on anorectal tissue MMP-9,IL-6,and TNF-α on acetic acid induced anal ulceration in rats(,n=10)

表5 消痔丸对醋酸诱导大鼠肛门溃疡模型肛门直肠组织中MMP-9、IL-6、TNF-α 含量的影响（，n=10）Table 5 Effects of Xiaozhi Pills on anorectal tissue MMP-9,IL-6,and TNF-α on acetic acid induced anal ulceration in rats(,n=10)

与对照组比较：***P＜0.001；与模型组比较：###P＜0.001***P <0.001 vs control group;###P <0.001 vs model group

3.4 消痔丸对大鼠肛门组织中iNOS、TGF-β1、VEGFA 蛋白表达的影响

如表6、图2 所示，与对照组比较，模型组肛门直肠组织中iNOS、VEGFA、TGF-β1 蛋白表达水平均显著增高（P＜0.001）。与模型组比较，各给药组可显著降低iNOS、VEGFA 蛋白表达水平（P＜0.001），消痔丸1.62、3.24 g/kg 组可进一步升高TGFβ1 蛋白表达水平（P＜0.05）。

图2 免疫组化检测各组大鼠肛门组织iNOS、VEGFA、TGF-β1 蛋白表达（×400）Fig.2 Expressions of iNOS,VEGFA and TGF-β1 protein in anorectal tissue of rats in each group detected by immunohistochemistry (×400)

表6 消痔丸对醋酸诱导大鼠肛门溃疡模型肛门直肠组织中iNOS、VEGFA、TGF-β1 蛋白表达的影响（，n=10）Table 6 Effects of Xiaozhi Pills on the expressions of iNOS,VEGFA and TGF-β1 protein in anorectal tissue of rats in each group (,n=10)

表6 消痔丸对醋酸诱导大鼠肛门溃疡模型肛门直肠组织中iNOS、VEGFA、TGF-β1 蛋白表达的影响（，n=10）Table 6 Effects of Xiaozhi Pills on the expressions of iNOS,VEGFA and TGF-β1 protein in anorectal tissue of rats in each group (,n=10)

与对照组比较：***P＜0.001；与模型组比较：#P＜0.05 ###P＜0.001***P <0.001 vs control group;#P <0.05 ###P <0.001 vs model group

4 讨论

中医认为气血不调，络脉瘀滞，蕴生湿热是痔疮的成因，与饮食起居、久站久行、便秘腹泻、妊娠分娩、遗传，以及风、湿、瘀、热等外因有关。现代医学关于痔的病因及发病机制研究较多，如肛垫下移学说、静脉曲张学说、血管增生学说，但尚未取得一致结论。目前对痔组织的研究认为痔组织主要由受损后异常扩张的静脉血管组成，静脉内常见血栓形成，此外还常伴有炎性改变（如淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞等炎性细胞浸润）、水肿和充血等，造成肛肠黏膜损伤，表面可见溃疡形成[5]。消痔丸由12 味药组成，方中地榆炭、白及、大黄等多味中药具有收敛固涩、消肿生肌等功效。现代药理研究发现，黄芪皂苷可抑制细胞间黏附分子 1（ICAM）、P-选择素的表达，降低iNOS 的合成和谷胱甘肽的消耗，起到预防和治疗肠道溃疡性结肠炎的作用[6]；地榆炭凉血止血，研究发现鞣质和钙离子的增加可显著缩短凝血时间并促进血小板聚集，发挥止血作用[7]；槐角可下调IL-6 水平，抑制一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）释放，抑制核因子κB（NF-κB）核转位和细胞外调节蛋白激酶（ERK）磷酸化，表现出良好的抗炎活性；另外还可缩短断尾小鼠的出血时间和凝血时间，具有明显的促进止血和凝血作用[8]；酒大黄中没食子酸、大黄酚等成分可发挥收敛止血作用，大黄素、芦荟大黄素等成分可发挥抗菌消炎作用，是有效对抗黏膜损伤和细菌感染的物质基础[9]；防己中的粉防己碱可通过抑制磷脂酶A2（PLA2），阻止单核细胞和中性粒细胞中PG 和白三烯的产生，对大鼠溃疡性结肠炎具有明确的改善作用[10]；白及可通过激活外源性、内源性凝血系统，调节6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）水平，促进血小板聚集，发挥止血功能，还可通过下调c-Jun 氨基末端激酶（JNK）及p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK）基因和蛋白表达水平，抑制炎症因子TNFα、IL-1β 等异常分泌发挥黏膜保护、抗溃疡作用，另外还具有促进创伤愈合和抗菌作用[11]。

醋酸致肛门溃疡法可致局部红肿、炎性渗出、溃疡改变，与痔急性发作期表现的疼痛、便血、红肿、渗出、黏膜糜烂等症状较为相近，且有维持时间较长、可重复性较好等优点[12]，采用该模型可以从保护黏膜损伤、抗炎消肿等多个角度，评价药物“消肿生肌”的功效。因此，本研究采用醋酸贴敷法诱导大鼠肛周溃疡模型，对肛周组织的大体观察发现消痔丸可显著加速溃疡面的愈合，缓解红肿和炎性渗出。微观病理上可见大鼠肛周黏膜上皮脱落减少，局部鳞状上皮层增厚明显减轻，肛周组织黏膜上皮和鳞状上皮缺损范围较模型组明显缩小，嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润减少，炎性渗出物，间质或黏膜下水肿和小血管扩张充血程度明显减轻，提示消痔丸对醋酸诱导的肛门溃疡具有明显的改善作用。

痔病临床症状多表现为坠胀、便血、疼痛等，这与病变黏膜炎性水肿、血管损伤密切相关，而炎症因子和炎症细胞对炎症过程具有决定作用。TNFα 是致炎作用最强、产生最快的炎症介质，一方面能够激活细胞Ca2+内流，释放血小板活化因子，促进血小板、淋巴细胞、白细胞黏附到肠黏膜的内皮细胞上，诱导iNOS 生成，从而产生大量NO，引起细胞损伤；另一方面TNF-α 与IFN-γ 的共同作用能够使肠上皮细胞的屏障功能及形态结构发生改变，进而增加肠黏膜和血管壁的通透性，最终破坏肠道黏膜的完整性，形成溃疡[13]。IL-6 通过转录激活因子3 途径激活NF-κB 信号通路而诱导细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的极化表达，ICAM-1 激活信号转导通路，介导淋巴细胞之间、淋巴细胞与靶细胞之间的黏附，进一步促进炎性细胞的浸润，加重肠黏膜的组织损伤[14]。炎症因子能对痔血管壁及血管内皮造成氧化损伤，被氧化损伤的血管壁又不断产生炎症因子，形成恶性循环[15]。另外，局部炎症可能导致基质支架的扭曲和痔垫的滑动，也可损伤固有层的小动脉，导致排便时糜烂出血[16]。MMPs 能降解细胞外蛋白质，如弹性蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白，研究发现IL-1、TNF-α 和脂多糖等促炎细胞因子可特异性诱导MMP-9 的上调，充分激活的MMPs 可破坏毛细血管床，增加肛垫病理性移位和出血的风险[17-18]。本研究发现，消痔丸可显著降低肛周组织中MMP-9、IL-6、TNF-α 含量，提示消痔丸可通过抑制炎症因子释放，有效减轻局部组织炎症水肿的发生。

正常的愈合过程是由多个细胞间信号的整合启动，包括角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、血小板等释放细胞因子和趋化因子。iNOS 主要在病理状态下由中性粒细胞、巨噬细胞产生，研究发现溃疡性结肠炎患者炎症黏膜上皮细胞iNOS 表达率为100%，黏膜固有层约半数炎性细胞表达iNOS[19]，能催化合成NO，而NO 是调节血液循环、血小板活性、神经传递、免疫和炎症过程的关键因子，发挥炎性介质作用。TGF-β1 是重要炎性细胞趋化因子，可趋化成纤维细胞和炎症细胞向伤口聚集，促进成纤维细胞大量合成胶原蛋白，促进创面底部小血管的内皮细胞的增生、分裂，诱导肉芽组织生长和表皮形成，研究发现在胃溃疡愈合过程中，内源性TGF-β1 表达呈由弱到强的表现[20]。VEGF 作用于血管内皮细胞和血管，参与炎症、损伤的修复，也是考察组织生长和创伤愈合的重要指标。在病理情况下，VEGF 含量增加可使毛细血管后静脉和小静脉的通透性增高而致使血液中的血浆蛋白、纤维蛋白、液体等外渗，导致周围间质水肿[21]。研究发现，痔组织水肿、出血的风险与VEGF阳性表达的增加呈正相关[22]。本研究发现，消痔丸可显著降低肛周直肠组织中iNOS、VEGFA 阳性表达，升高TGF-β1 阳性表达，提示消痔丸具有抑制炎症反应，促进溃疡愈合的作用。

综上所述，消痔丸通过抑制IL-6、TNF-α、MMP-9 相关细胞因子分泌和iNOS、VEGFA 蛋白表达，升高TGF-β1 表达对醋酸诱导的肛门溃疡具有保护作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突