刘浩,张辛芸,杨宇萍,范潇晓,王文琪,梁敬臣,刘永刚*
1.北京中医药大学,北京 100029
2.北京三和丽生物科技有限公司,北京 100068
白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病,患病率为全球人口的0.5%~2%,临床表现为头面部、颈部、手、足等部位出现白斑[1-3]。白癜风的发病机制尚不明确,中医学认为,白癜风属于“白驳风”“斑驳”“白癜”等范畴,风邪相搏、气血失和、脉络瘀阻为此病的病因病机[4-5]。现代医学认为白癜风的发病机制主要集中在自身免疫学说、黑色素细胞凋亡学说、氧化应激学说、遗传与环境因素学说等方面[4,6-8]。
甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根茎,具有补中益气、缓急止痛、清热解毒、化痰止咳、调和药性等诸多功效[9]。甘草中主要含有三萜类、黄酮类等多种化学成分,其中,甘草酸苷作为甘草中的重要活性成分,具有活化T细胞和自然杀伤细胞(NK 细胞),促进T 淋巴细胞分化,诱导γ-干扰素产生,从而直接减少黑素细胞的损伤,恢复黑素细胞的功能[10]。因此,临床上常使用复方甘草酸苷片对白癜风进行治疗[11-12]。
为了分析甘草治疗白癜风的物质基础和作用机制,本研究基于网络药理学的相关方法[13],系统分析甘草治疗白癜风的主要活性成分、核心靶点以及通路,以期为后续研究提供参考。
使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php/),设置筛选条件为化合物的口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18[14],检索得到甘草中的活性成分。使用PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取活性成分的“Canonical SMILES”,将其输入SwissTargetPrediction 数据库(http://www.swiss targetprediction.ch/)预测得到各个活性成分的靶点蛋白名称,即为甘草中活性成分的作用靶点。
使用OMIM 数据库(https://www.omim.org)和GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/),以“vitiligo”为关键词检索获取白癜风的相关靶点。
将甘草中活性成分的靶点和白癜风的靶点导入微生信数据分析平台(https://www.bioinfor matics.com.cn)得到甘草-白癜风的交集靶点,并制作Venn 图。
将甘草中的活性成分及其作用靶点与白癜风相关靶点的交集导入Cytoscape 3.9.1 软件,利用Cyto NCA 插件对网络中各个节点进行拓扑学参数分析,以“中介中心性(betweenness)、亲密性(closeness)、特征向量(eigenvector)大于中位数”为筛选条件[15],获取得到甘草治疗白癜风的主要活性成分。将甘草主要活性成分及其作用靶点与白癜风相关靶点的交集导入Cytoscape 3.9.1 软件,构建得到“甘草主要活性成分-白癜风靶点”网络。
将甘草-白癜风的交集靶点导入String 数据库(https://string-db.org/),以物种限定为Homo sapien、高置信度 0.700 为筛选条件,所得数据导入Cytoscape 3.9.1 软件对PPI 网络进行可视化处理,利用Cyto NCA 插件对PPI 网络中各个节点进行拓扑学参数分析,根据degree 值大小,筛选得到甘草治疗白癜风的核心靶点。
以“Homo sapiens”为条件,使用Metascape 数据库(http://metascape.org)对甘草-白癜风的交集靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。将分析结果导入微生信数据分析平台(https://www.bio informatics.com.cn),制作GO 功能富集分析柱形图和KEGG 通路富集分析气泡图。
使用PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找甘草主要活性成分的2D 结构,为小分子配体。以“Homo sapiens”和“X-RAY DIFFRACTION”为筛选条件,使用PDB 数据库(https://www.rcsb.org/)查找核心靶点蛋白的3D 结构,为蛋白受体。使用PyMol 3.7.3 软件对蛋白受体进行去除水分子、添加氢原子等操作,使用AutoDockTools 1.5.7 将二者进行分子对接,通过PyMol 软件进行可视化处理。
筛选得到符合条件的化学成分92 种,其中,7-甲氧基-2-甲基异黄酮、鳞叶甘草素B、8-(6-羟基-2-苯并呋喃基)-2,2-二甲基-5-色烯醇等8 种化学成分没有对应的作用靶点,剩余84 种化学成分为甘草中的活性成分见表1。并检索得到84 种活性成分的作用靶点共8 400 个。
表1 甘草活性成分Table 1 Active ingredients of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
通过GeneCards 和OMIM 数据库获得白癜风相关靶点1 349 个。使用微生信数据分析平台对白癜风相关靶点与甘草活性成分的作用靶点进行映射,得到甘草-白癜风的交集靶点133 个,见图1。
图1 甘草-白癜风Venn 图Fig.1 Venn diagram of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and vitiligo
使用Cytoscape 3.9.1 软件进行网络拓扑学参数分析,经过中位数筛选后,选取谷甾醇、格里西轮、光果甘草宁、(2S)-7-羟基-2-(4-羟基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黄素6 个化学成分作为甘草中的主要活性成分,见表2。将甘草中6 个主要活性成分及133 个交集靶点导入Cytoscape 3.9.1 软件,构建得到“甘草主要活性成分-白癜风靶点”网络,见图2。共得到135个节点,398 条边(节点表示药物、活性成分和作用靶点,边表示3 者之间的相互作用)。
图2 甘草主要活性成分-白癜风靶点网络图Fig.2 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma active ingredient-vitiligo target network diagram
表2 甘草治疗白癜风主要活性成分Table 2 Main active components of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in treatment of vitiligo
将甘草-白癜风的133 个交集靶点输入String数据库,构建PPI 网络。使用Cytoscape 3.9.1 软件对PPI 网络进行可视化处理,得到甘草-白癜风交集靶点PPI 网络可视化图,见图3,共133 个节点,464 条边。根据degree 值,筛选得到蛋白激酶B1(Akt1)、信号传导和转录激活蛋白3(STAT3)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、有丝分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)6 个靶点作为甘草治疗白癜风的核心靶点,见表3。靶点的degree 值越大,颜色越深,表明其可能是甘草治疗白癜风的核心靶点。
表3 甘草治疗白癜风的核心靶点Table 3 Core target of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in treatment of vitiligo
GO 功能富集分析中,生物过程(BP)共1 601条,主要包括细胞对肽激素的反应(cellular response to peptide hormon)、对肽激素的反应(response topeptide hormone)、细胞对肽的反应(cellular response to peptide)、对肽的反应(response to peptide)、细胞对氮化合物的反应(cellular response to nitrogen compound)等;细胞组分(CC)共60 条,主要包括血小板α 颗粒管腔(platelet alpha granule lumen)、血小板α 颗粒(platelet alpha granule)、分泌颗粒管腔(secretory granule lumen)、胞质囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、囊泡腔(vesicle lumen)等;分子功能(MF)共138 条,主要包括蛋白磷酸酶结合(protein phosphatase binding)、磷酸酶结合(phosphatase binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、蛋白质丝氨酸激酶活性(protein serine kinase activity)等。通过微生信数据分析平台制作得到GO 功能富集分析柱形图,见图4。
图4 GO 功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis
KEGG 通路富集分析结果显示,甘草治疗白癜风的通路共183 条。将排名前20 位的KEGG 通路富集分析结果输入微生信数据分析平台,制作得到KEGG 通路富集分析气泡图,见图5。由图5 可知,甘草治疗白癜风的靶点主要涉及的信号通路有糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、C-型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、人T 细胞白血病病毒1 型感染(human T-cell leukemia virus 1 infection)、人巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、癌症中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、癌症通路(pathways in cancer)、细胞凋亡(apoptosis)、乙型肝炎(hepatitis B)、细胞衰老(cellular senescence)等。
图5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis
甘草的主要活性成分为谷甾醇、格里西轮、光果甘草宁、(2S)-7-羟基-2-(4-羟基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查尔酮B、刺芒柄花黄素。使用软件AutoDockTools 1.5.7 将其分别与核心靶点VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1进行分子对接。分子对接的结合能越小,表明小分子配体和蛋白受体之间互作的可能性越大。由表4可知,谷甾醇、格里西轮、光果甘草宁、(2S)-7-羟基-2-(4-羟基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黄素 6 个主要活性成分与核心靶点VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1 显示出较好的结合,其结合能较低表示出其具有一定的结合力,使用PyMol 软件进行处理,得到可视化网络图,见图6。
图6 核心靶点与甘草主要活性成分的分子对接结果Fig.6 Molecular docking of core targets with the main active components of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
表4 分子对接结果Table 4 Molecular docking results
研究表明,甘草中的主要活性成分甘草酸可提高酪氨酸酶活性,促进黑色素合成,以此发挥治疗白癜风的作用[16-17]。以甘草酸苷为主要成分的复方甘草酸苷片具有活化T 细胞和NK 细胞,促进胸腺外T 淋巴细胞分化和黑色素生成的功能,因其治疗效果较好,无明显毒副作用成为临床治疗白癜风的主要制剂[18-19]。为了进一步探索甘草治疗白癜风的作用机制,本研究通过网络药理学的相关方法筛选得到甘草中的活性成分84 种,其中治疗白癜风的主要活性成分为谷甾醇、格里西轮、光果甘草宁、(2S)-7-羟基-2-(4-羟基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黄素。
PPI 网络结果显示,Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 可能为甘草治疗白癜风的核心靶点。Akt1 作为AKT 的异构体之一,主要参与细胞凋亡过程[20];STAT3[21]、TNF[22]、MAPK1[14]主要与炎症反应密切相关;IL-6 为一种26-kD 分泌蛋白,具有刺激B 细胞产生抗体的作用,在免疫反应中发挥重要作用[23-24];VEGFA 是血管内皮生长因子,经典的VEGF 信号通过VEGFR1/R2 调节几种激酶的活性,最终在血管生成和血管生成过程中指导细胞增殖、迁移、存活和血管通透性[25]。综上所述,甘草治疗白癜风的6 个核心靶点主要与细胞凋亡、炎症反应和免疫过程等密切相关。由此可推测,甘草中的谷甾醇、格里西轮、光果甘草宁、甘草查耳酮B 等通过作用于Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 等靶蛋白,抑制黑色素细胞凋亡、抗炎、调节免疫过程等发挥治疗白癜风的作用。
GO 功能富集分析结果显示,甘草治疗白癜风的核心靶点Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 主要是通过细胞对肽激素的反应、对肽激素的反应、细胞对肽的反应、对肽的反应、细胞对氮化合物的反应等生物过程发挥治疗白癜风的作用。KEGG 通路富集分析结果显示,甘草治疗白癜风的靶点主要涉及的信号通路包括C-型凝集素受体信号通路、人T 细胞白血病病毒1 型感染、癌症通路、细胞衰老和凋亡、乙型肝炎等。其中C-型凝集素受体信号通路是通过识别病原、损伤以及肿瘤相关分子模式上的配体,从而发挥调节免疫功能的作用[26]。
分子对接结果显示,甘草中的主要活性成分谷甾醇、格里西轮、光果甘草宁、(2S)-7-羟基-2-(4-羟基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黄素与核心靶点VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1 的结合能均小于0,表明甘草中的主要活性成分可以与核心靶点进行结合,形成氢键相互作用,反映了甘草治疗白癜风具有多靶点、多通路的特点,验证了使用网络药理学相关方法进行筛选的合理性。
综上所述,甘草可能通过谷甾醇、格里西轮、光果甘草宁、(2S)-7-羟基-2-(4-羟基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黄素等活性成分,调节细胞凋亡、免疫功能、炎症等相关通路中的核心靶点Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 发挥治疗白癜风的作用,阐释了甘草治疗白癜风的作用机制,可以为甘草治疗白癜风的深入研究提供理论参考。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突