试析PCR 技术在食品微生物检测中的运用策略

◎ 邹晓花，方瑞雪

（西部第三方检测集团（宁夏）有限公司，宁夏 银川 750021）

本文旨在试析PCR（聚合酶链反应）技术在食品微生物检测中的运用策略。通过系统研究PCR 技术的原理、步骤和应用案例，探讨了如何选择合适的微生物目标、优化前处理步骤、设计特异性引物和探针，并优化PCR 反应条件，以提高食品微生物检测的准确性和效率。

1 PCR 技术在食品微生物检测中的优势和挑战

1.1 优势

①PCR 技术具有高度的灵敏性和特异性，可以检测微生物目标的低浓度。由于PCR 反应能够扩增目标DNA 序列，即使微生物目标在食品样品中的浓度非常低，也能够通过PCR 放大到足够的数量进行检测。同时，通过正确设计引物和探针，可以确保PCR 反应的特异性，只检测特定的微生物目标，避免误报和交叉反应。②PCR 能够在短时间内完成目标DNA 的扩增和检测。PCR 反应的周期时间可以在几小时内完成，有效提升食品微生物检测速度，提供及时的结果。③PCR 技术可以通过前处理步骤去除样品中的抑制物质，并通过扩增目标DNA 的方法，克服复杂样品的困难，提供更可靠的检测结果[1]。

1.2 挑战

①食品样品的复杂性和多样性，是PCR 技术在食品微生物检测中面临的挑战之一。不同食品样品的成分和特性各不相同，可能导致样品前处理和DNA 提取过程困难。②样品中的抑制物质和基质干扰可能影响PCR 反应的效果，导致假阴性或假阳性结果。因此，在PCR 技术中，检测人员需要考虑抑制物质的存在，并采取相应措施减轻其影响，如优化DNA 提取方法和使用特殊试剂来消除抑制物质。③PCR 技术在食品微生物检测中需要特定的实验室设备和技术要求，包括温控设备、PCR仪器、核酸提取设备和引物设计软件等。④PCR 技术需要熟练的试验操作和技术知识，以确保PCR 反应的可靠性和重复性[2]。

2 PCR 技术在食品微生物检测中的战略应用

PCR 技术作为一种强大的分子生物学工具，已经在食品微生物检测领域展现了广泛的应用前景。其在食品安全保障中的战略性应用，不仅可以提高检测的灵敏度和特异性，还可以加速检测过程，从而更好地满足快速鉴定和检测的需求。

2.1 靶标选择与设计策略

2.1.1 靶标基因的重要性与选择原则

在食品微生物检测中运用PCR 技术时，靶标基因的选择是确保检测结果准确性和可靠性的关键因素。具体而言，靶标基因作为PCR 扩增的目标，在决定检测灵敏度和特异性的同时，也影响着分析的可行性和实用性。合理选择靶标基因可以使PCR 技术更好地适应不同食品样品的微生物检测需求。通常情况下，选择在目标微生物中具有高度保守性和特异性的基因片段作为靶标是必要的。其中，保守性指的是基因在不同菌株中的序列保持相对稳定，以确保在多样的微生物群体中同样能被扩增；特异性是确保引物和探针仅与目标微生物的基因序列匹配，避免与其他非目标微生物的DNA 片段发生交叉反应。作为一个成功的靶标基因，16S rRNA 基因在大多数细菌中具有高度保守性，因此被广泛应用于微生物鉴定。这一基因区段在细菌中扮演重要的生物学功能，其序列在不同菌株之间的变异性相对较小，使其成为微生物分类学和鉴定的理想选择。

2.1.2 引物与探针设计的考虑因素

靶标基因片段的交叉反应，是在PCR 技术中需要谨慎考虑的重要问题之一。在食品微生物检测中，可能存在多种微生物种类，其基因组中的某些片段可能相似，导致引物与非目标微生物的DNA 产生交叉反应。这种交叉反应可能导致假阳性结果，从而误导检测结果。因此，在选择引物时，检测人员需要特别关注其独特性和特异性。其中，引物的独特性和特异性可以通过生物信息学工具进行预测和分析。在引物设计的初期，检测人员可以使用多序列比对分析，比较目标微生物和非目标微生物的基因序列，找到具有较高特异性的区域作为引物的扩增目标。探针设计应考虑以下因素。①特异性结合：探针的序列应该与引物扩增产物的特定区域相匹配，从而实现特异性结合。这可以通过确保探针序列仅与目标基因序列的特异性部分匹配来实现。②独特性：与引物一样，探针的序列应该在目标微生物和非目标微生物中具有足够的独特性，以避免交叉反应。生物信息学工具可以用来分析可能的交叉反应情况。③标签的选择：探针上的荧光标签和探针的修饰，对于检测的灵敏度和特异性有影响。荧光标签应具有稳定性和高信号强度，以确保在PCR反应中可靠地检测到信号。

2.2 样本处理与前处理策略

2.2.1 样本来源与处理的挑战

在食品微生物检测中，样本的来源和处理是影响PCR 技术应用的重要因素之一。食品样本的复杂性可能对PCR 的准确性和灵敏度产生影响。不同食品类型的样本可能包含不同的成分，如脂肪、蛋白质、糖类等，这些成分可能干扰PCR 反应，影响检测结果的可靠性。此外，食品样本中可能还存在各种抑制因子，如多种化学物质、酶抑制剂等，也可能阻碍PCR 扩增的进行。这些样本复杂性带来的挑战需要在样本处理过程中克服，以确保PCR 反应的可靠性和准确性。否则，可能会导致假阴性或假阳性的结果，影响食品微生物检测的准确性[3]。

2.2.2 去除抑制因子的方法与策略

为了克服食品样本中的抑制因子，样本前处理过程至关重要。当前，有多种方法和策略可以帮助减少抑制效应，保障PCR 检测的准确性[4]。①使用特定的提取试剂盒：不同的提取试剂盒可以针对不同食品类型的样本特性，选择适当的方法进行核酸提取，以有效分离核酸，并去除一些抑制因子。②酶处理：酶的加入可以在核酸提取过程中分解一些抑制性物质，如蛋白质酶、脂肪酶等，有助于减少抑制效应，提高PCR 反应的成功率。③离心：通过离心操作，可以将样本中的固体颗粒沉淀，分离出液相，从而降低抑制性物质的含量。④稀释样本：对于特别浓缩或含有高浓度抑制因子的样本，可以进行适当的稀释，从而降低抑制效应。⑤内标物质的使用：内标物质是已知的DNA 片段，与待测的目标基因一起扩增。内标物质的存在可以帮助判断PCR 反应是否受到抑制，从而验证结果的可靠性。

2.3 反应条件优化策略

2.3.1 温度循环参数的优化与稳定性

PCR 反应的温度循环参数对于扩增效率和产物特异性具有重要影响。①在PCR 过程中，温度循环通过不同温度阶段的切换来实现DNA 的变性、退火和延伸。因此，优化这些温度循环参数可以显著提高PCR 反应的效率和准确性。通过调整退火温度，可以确保引物在目标DNA 序列上结合的特异性。②延伸时间的优化也至关重要。延伸时间应足够长，以确保DNA 聚合酶充分扩增目标序列，同时也应避免过长的延伸时间，以免引起非特异性扩增或引物的降解。③扩增周期数的选择取决于起始DNA 模板的初始浓度以及所需的扩增量。适当的周期数可以在不引起副产物的情况下达到足够的扩增。

2.3.2 反应体系组成的调控与优化

①PCR 反应体系的组成是影响PCR 反应效率和产物稳定性的重要因素之一。合理的反应体系组成可以确保引物和核酸模板之间的充分结合，以及酶的高效催化。在反应体系中，核酸模板的浓度应该处于合适的范围内，以确保扩增的效率和特异性。引物和探针的浓度也需要经过优化，以避免过高或过低的浓度对反应的影响。②反应体系中，缓冲液的选择和浓度影响pH 值的稳定，从而影响酶的活性。适当添加酶抑制剂可以防止酶在PCR 反应开始前不受控制的活性，从而保证反应的稳定性[5]。

2.4 数据分析与结果解释策略

2.4.1 分析PCR 产物的方法与工具

当前，有多种方法和工具可以用于分析PCR 产物。①凝胶电泳是一种常用的分析方法，通过将PCR 产物在凝胶中进行电泳分离，可根据产物的大小判断PCR扩增是否成功。然而，凝胶电泳能够提供关于PCR 产物大小的信息，但无法进行定量分析。②毛细管电泳是一种高效分离和定量分析PCR 产物的方法。它通过在毛细管中进行电泳分离，根据PCR 产物的大小和电荷来分析样品。③实时荧光PCR 是一种广泛应用于PCR 分析的技术。它可以提供实时监测PCR 产物积累量的信息，通过荧光信号的强度来反映目标基因的丰度。实时荧光PCR 可以用于定量分析，计算阈值周期数（Ct 值），从而比较不同样本中目标基因的数量。④数据分析工具和软件，在PCR 产物分析中扮演着重要角色。这些工具可以用于解释实时荧光PCR 的结果，绘制荧光曲线和标准曲线，计算Ct 值以及进行样品间和批次间的比较与分析。

2.4.2 结果的可靠性和准确性的验证

为了确保PCR 结果的准确性和可靠性，需要进行严格的验证步骤。①阳性和阴性对照样本：阳性对照样本可以包含已知目标基因序列，用于验证PCR 的灵敏度和特异性。同时，阴性对照样本可以用于检测是否存在潜在的污染。②重复性试验：进行多次独立的PCR试验，可以验证结果的可重复性和稳定性。通过比较不同试验之间的结果，可以评估PCR 反应的一致性和稳定性。③平行试验：同时进行多个平行试验，可以评估试验的一致性，帮助排除试验中可能的随机误差。通过上述验证步骤，可以确保PCR 检测结果的可靠性和准确性，有助于排除假阳性和假阴性结果，提高PCR 技术在食品微生物检测中的可信度和应用价值。

3 结语

综上所述，PCR 技术在食品微生物检测中具有巨大的潜力和广泛的应用前景。随着技术的不断发展和改进，PCR 技术将在食品微生物检测中发挥越来越重要的作用，为人们提供更加可靠和高效的食品安全保障。