通督调神灸对大脑中动脉阻塞大鼠学习记忆及轴突再生的影响

刘芳，郭佳颖，林少鸿，侯玉菲，陈鑫

(福建中医药大学，福建 福州 350122)

卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是卒中后常见的并发症之一。一项大型国际队列研究结果表明，PSCI发病率高达24%-53.4%[1]，我国最新的《卒中后认知障碍管理专家共识》显示，约1/3的卒中幸存者患有PSCI，PSCI对卒中病人的生活质量及生存时间产生了严重影响[2]。学习记忆障碍是PSCI患者最首要的特征，也是引起卒中持久后遗症的主要因素[3]。艾灸作为其中不可或缺的一种非侵入性中医外治法，是中风的中医特色护理技术之一[4，5]。“通督调神灸”是艾灸中的一种重要类型，其“通督”的治疗总纲领与历代医家强调的“病变在脑，首取督脉”一致，成为了临床PSCI治疗中最常用的艾灸类型，但其作用机制尚不明确。有研究发现，脑缺血区域的存活神经元可通过轴突再生(即损伤神经元的轴突末端形成生长锥)与损伤区附近皮层重新建立连接，从而改善神经功能。Cofilin是一种肌动蛋白相关蛋白，它定位于生长锥，研究显示其与卒中以及认知障碍的发生发展存在着一定的联系[6，7]。本研究通过观察通督调神灸干预对大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠神经缺损情况、学习记忆能力、脑梗死情况、神经元凋亡、轴突再生及Cofilin的影响，探讨通督调神灸对MCAO大鼠学习记忆能力的干预效果及作用机制，为通督调神灸在PSCI患者临床康复护理中的推广和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

45只成年健康雄性SD大鼠[许可证号码：SCXK(沪)2017-0005]购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，体质量250-300 g，于福建中医药大学实验动物中心[许可证编号:SYXK(闽)2020-0003]适应性喂养一周。实验经福建中医药大学动物实验管理委员会批准(伦理号：2021159)。分组采用随机数字表，分为假手术组、模型组和通督调神灸组3组，15只/组。

1.2 模型制备

所有大鼠于术前禁食12 h，对模型组和通督调神灸组大鼠进行左侧MCAO手术。具体步骤：①大鼠称重后，20%乌拉坦注射液0.6 mL/100 g腹腔注射麻醉；②充分麻醉后，仰卧固定头部和四肢于实验鼠板，颈部充分暴露后备皮，消毒；③从颈部正中线剪开皮肤，钝性分离并结扎左侧颈总动脉和颈外动脉；④颈内动脉被钝性分离后用血管夹夹闭其远心端；⑤在颈总动脉结扎处远端0.5 mm处剪一小口，将MCAO模型线栓由颈总动脉开口处插入颈内动脉；⑥松开血管夹，将线栓继续推入至遇少许阻力，深度约为20 mm，即表明线栓已进入大脑中动脉内，记录时间；⑦将颈内动脉及线栓一同结扎，常规缝合、消毒颈部手术切口并使线栓尾部暴露在皮肤之外，腹腔注射庆大霉素注射液后将大鼠放于恒温加热垫上保暖直至苏醒；⑧待线栓插入1.5 h后将线栓部分拔出以实现大脑中动脉的缺血再灌注，最后将切口外线栓剪断完成造模。待大鼠清醒后，根据Zea-Longa神经功能缺损评分法[8]判断造模是否成功，评分为1-3分表明MCAO大鼠造模成功。假手术组仅进行分离动脉操作，未结扎和插栓等。

1.3 干预措施

通督调神灸组于造模后第2天开始对大鼠进行通督调神灸干预，即一手抓取大鼠并用食指和中指对其头部稍加固定，一手持点燃后的艾条(直径约8 mm)，在大鼠百会穴上方20-30 mm处施灸，穴位定位参照《实验针灸学》[9],20 min/次,1次/d,持续干预7 d[10]。另外两组给予同等条件抓取，无其他干预。

1.4 评价指标

1.4.1 神经功能缺损评分

于造模清醒后2 h及干预7 d后进行Zea-Longa评分评估各组大鼠的神经功能缺损情况。

1.4.2 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验包括定位航行和空间探索两部分实验，用以评估大鼠的学习记忆能力。定位航行实验：于干预第2-6天进行。将大鼠面朝池壁顺序从四个象限放入水中，若于90 s内找到平台并停留时间达3 s以上，寻找平台成功，所耗费时间即为逃避潜伏期；若大于90 s仍未能找到平台，则记为90 s，四个象限的平均值即为逃避潜伏期，实验结束后用毛巾将大鼠擦干并置于烤灯下烘干保暖。空间搜索实验：于艾灸干预7 d后，平台移除后将大鼠从第一象限放入水中，记录其90 s内穿越平台的次数。

1.4.3 脑梗死体积测定

于造模24 h后及干预7 d后采用micro-MRI对各组大鼠的头部进行扫描，观察大鼠左侧脑梗死体积。大鼠吸入麻醉后，俯卧位固定于扫描床上，采用T2加权成像(T2-weighted imaging，T2WI)扫描。扫描结束后，运用Image J图像处理软件计算脑梗死体积百分比，即每层脑梗死面积×(层间距+层厚)/同一层全脑面积×(层间距+层厚)×100%。

1.4.4 TUNEL染色

采用20%乌拉坦对大鼠进行深度麻醉，全麻后取仰卧位，开胸暴露心脏，于心尖剪一小口，将已消毒的灌胃针从心尖插至升主动脉并用止血钳夹闭灌胃针及心脏以便固定。于右心耳处剪一小口，释放静脉血，使用针筒向灌胃针中快速注入150 mL 0.9%氯化钠溶液去除血液，再用150 mL 4%多聚甲醛溶液(pH值=7.3)进行固定。当大鼠处于四肢抽搐，明显僵直状态时，使用断头铡，快速断头取全脑。全脑组织使用4%多聚甲醛浸泡，4℃冰箱保存24 h固定后，流水冲洗，切除嗅球，按4∶3∶3比例进行切割，切割完毕放于70%乙醇溶液中浸泡过夜。次日将浸泡完毕组织置于包埋盒中，脱水后用石蜡包埋。从脑组织的冠状位，进行4 μm厚度切片。于约37℃温水中进行摊片，使用载玻片将切片捞起烘干。将制备完成的脑组织切片放于60℃环境中复温30 min，再用二甲苯脱蜡后滴加蛋白酶K工作液，置于20-37℃的环境反应15 min至30 min，再漂洗3次。各样品滴加50 μL TUNEL检测液进行上样，避光，37℃，反应1 h，反应结束后 3次洗涤。封片使用抗荧光淬灭封片液，镜下观察。蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为凋亡细胞。每片随机选取5个视野。使用Image-Pro-Plus(IPP)软件计数凋亡细胞数量，细胞凋亡率=绿色荧光数/蓝色荧光数×100%。

1.4.5 免疫组化

取材、包埋及切片制备同TUNEL染色。将样本完全浸于抗原修复液中加热煮沸10 min，待自然冷却至室温后漂洗3次，3 min/次。将样本周围多余液体拭去后，沿样本周围用免疫组化笔画出隔水带。样本上滴加内源性过氧化物酶阻断液，室温下孵育10 min后漂洗3次。加GAP-43一抗(浓度1∶200)4℃孵育过夜，再滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。按所购试剂盒说明书配置DAB工作液并滴加到待测样本上，室温孵育1-5 min(具体反应时间可在显微镜下观察并进行控制)，随后用纯水进行洗涤。使用Mayer’s苏木素对样本复染10 min，再用纯水冲洗，PBS反蓝。将样本脱水，树胶封片，待干后置于镜下进行观察、拍照。每个切片任意选取5个视野拍照，计算平均光密度，即视野中阳性表达部位累积光密度/视野下样品面积。

1.4.6 免疫荧光

取材、包埋及切片制备同TUNEL染色。抗原热修复同免疫组化染色。将样本置于硼氢化钠溶液中室温反应30 min后自来水冲洗5 min，再将样本放入75%乙醇溶液中浸泡1 min，最后将样本置于苏丹黑染液中室温反应15 min，随后用自来水冲洗5 min。用滤纸擦去样本周围多余液体，并用免疫组化笔在玻片上的样本周围画出隔水带。在样本上滴加山羊血清，室温下封闭60 min后滴加GAP-43一抗(浓度1∶100)，4℃孵育过夜；滴加二抗，37℃孵育60 min后漂洗3次，采用含DAPI的抗荧光淬灭封片液进行封片，待干后于荧光显微镜下观测、拍照。

1.4.7 免疫印迹

《中国储运》创刊于1990年，经国家新闻出版署批准出版，面向海内外公开发行，国内统一刊号CN12-1204/F，邮发代号6-151。国际16开铜版彩印，月刊，国际标准刊号ISSN1005-0434，国外发行代号BM1821。

采用20%乌拉坦注射液按0.6 mL/100 g进行腹腔注射麻醉后迅速断头取全脑，分离出左侧海马组织置于液氮中，存于-80℃冰箱中保存。取100 mg组织样品放入800 μL按比例提前配置好的裂解液混合物相应组别冻存管中并剪碎组织，将冻存管置于研磨仪中进行研磨处理，超声10 min，随后于冰上静置20 min使其充分裂解，4℃，14 000 r/min(r=6 cm)，离心20 min，取蛋白上清液按试剂盒说明书配置BCA工作液检测蛋白质浓度，以1∶4的比例进行上样，7 500 r/min(r=6 cm)，离心5 min后置于100℃金属浴锅中，加热10 min。按试剂盒说明书配胶，上样，电泳，转膜，顺序一抗孵育、二抗孵育。按试剂盒说明书配置ECL，滴加于漂洗后的PVDF膜上避光反应1 min，最后在化学发光成像系统中进行观察、拍照。用Image Lab软件进行条带分析。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 各组最终完成实验的大鼠情况

最终假手术组完成试验大鼠15只；模型组和艾灸组大鼠因造模时大出血死亡、麻醉不耐受死亡及造模不成功剔除，最终模型组完成实验13只，艾灸组13只。

2.2 通督调神灸对MCAO大鼠神经功能缺损评分的影响

造模清醒后2 h，假手术组未出现神经功能缺损评分为0分，模型组和通督调神灸组大鼠出现不同程度的神经功能缺损，其评分较假手术组高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明造模成功。同时，模型组与通督调神灸组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，提示在干预前两组大鼠的神经功能缺损程度具有可比性。干预7 d后与模型组相比，通督调神灸组评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。提示通督调神灸可有效减轻MCAO大鼠的神经功能缺损程度。

表1 各组大鼠Zea-longa评分 分

2.3 通督调神灸对MCAO大鼠学习记忆能力的影响

对3组大鼠干预第2-6天的逃避潜伏期进行重复测量方差分析，结果显示，干预第2-6天，与其他两组相比，假手术组的逃避潜伏期短，差异具有统计学意义(P<0.05)；通督调神灸组逃避潜伏期于干预第4-6天均明显低于模型组，差异有统计学差异(P<0.05)，见表2。对干预第7天各组大鼠的穿越平台次数进行组间比较结果显示，假手术组高于模型组和通督调神灸组，通督调神灸组高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。以上结果表明通督调神灸能够有效改善MCAO大鼠的学习记忆能力。

表2 各组大鼠逃避潜伏期 秒

表3 各组大鼠90 s内穿越平台次数 次

2.4 通督调神灸对MCAO大鼠脑梗死体积的影响

造模后24 h，与假手术组相比，模型组和通督调神灸组脑梗死体积明显增大，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明造模成功；模型组与通督调神灸组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，可见两组大鼠在干预前脑梗死体积具有可比性。干预7 d后，与模型组相比，通督调神灸组脑梗死体积缩小明显，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4、图1。表明通督调神灸能有效减小MCAO大鼠的脑梗死体积。

注:高信号白色区域为缺血梗死灶

表4 各组大鼠的脑梗死体积百分比

2.5 通督调神灸对MCAO大鼠神经元凋亡的影响

注:蓝色荧光为正常神经元,绿色荧光为凋亡神经元(标尺25 μm)

表5 各组神经元凋亡率

2.6 通督调神灸对MCAO大鼠GAP-43的影响

采用免疫组化法对各组大鼠梗死侧海马区的GAP-43进行半定量分析，以平均光密度值代表GAP-43水平高低。对各组大鼠平均光密度值进行组间比较，结果显示，与假手术组相比，模型组和通督调神灸组的平均光密度值增加，而通督调神灸组较模型组更高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表6和图3。大鼠梗死侧海马区的GAP-43免疫荧光染色结果可见，GAP-43主要表达于细胞质中，模型组和通督调神灸组的红色荧光(GAP-43)强度均高于假手术组，且通督调神灸组的红色荧光强度在所有组别中最高，GAP-43表达量最高，见图4。以上免疫组化和免疫荧光结果表明通督调神灸干预能够升高MCAO大鼠梗死侧海马区的GAP-43水平。

注:阳性染色结果为黄色或棕黄色

注:红色荧光为GAP-43,蓝色荧光为神经元细胞(标尺25 μm)

表6 各组大鼠GAP-43免疫组化平均光密度值

2.7 通督调神灸对MCAO大鼠Cofilin表达的影响

对各组大鼠左侧海马组织Cofilin蛋白表达量进行比较，结果显示，模型组和通督调神灸组较假手术组升高，通督调神灸组较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表7、图5。以上结果表明通督调神灸可降低MCAO大鼠海马中Cofilin表达量，说明通督调神灸可促进轴突再生可能与调控Cofilin有关。

图5 各组大鼠海马组织相关蛋白检测结果

表7 各组大鼠Cofilin表达情况

3 讨论

3.1 通督调神灸可减轻MCAO大鼠神经功能缺损，缩小脑梗死体积

通督调神理论是由全国名老中医张道宗教授提出的，是通过通调督脉调治全身脏腑从而对疾病达到治疗效果的学术思想[11]。通督调神灸是由通督调神理论延伸、发展而来，以艾灸督脉腧穴作为主要方式，对疾病进行治疗，在临床治疗中已被证实具有疏经通络、调神益气、补髓健脑的作用[12]。本研究结果显示，模型组和艾灸组大鼠经MCAO造模后出现明显的神经功能缺损情况，同时micro-MRI图像显示MCAO造模后大鼠的左侧皮层及海马组织均出现大面积的缺血梗死灶且梗死体积相当，表明MCAO大鼠均造模成功且梗死部位及梗死程度相当，具有可比性。在经过7 d的通督调神灸干预之后，艾灸组大鼠的神经功能缺损评分降低，脑梗死体积显著缩小，较模型组改善程度显著。可见，通督调神灸可以有效改善MCAO大鼠的神经功能缺损及脑梗死的体积。艾灸可通过其燃烧物效应、温热刺激效应、红外光谱共振效应等作用于人体腧穴从而产生治疗效果。其中温热效应是艾灸产生疗效的主要方式，艾灸的温热刺激能舒张人体局部及深层的血管，赵宁侠等人的研究表明艾灸百会穴能增加人大脑中动脉及后动脉的血流动力[13]。姚宝农等[14]使用艾灸仪对中风患者的百会穴进行艾灸后发现，艾灸可明显改善脑缺血病人的大脑血液循环，经治疗后其神经功能缺损程度有了显著改善，说明通督调神灸可能是通过其温热效应改善MCAO大鼠脑血流情况以改善MCAO大鼠的脑梗死体积及神经功能。此外，蒋洁等[15]的研究表明艾灸可有效减轻MCAO大鼠的神经功能缺损，减小脑梗死体积，促进神经功能的康复，与本研究结果一致。

3.2 通督调神灸可改善MCAO大鼠学习记忆能力

本研究发现，在通督调灸干预第4-6天后，与模型组相比，通督调灸组的逃避潜伏期明显缩短，在通督调灸干预第7天后，穿越平台次数明显增多，说明通督调神灸干预后MCAO大鼠的学习记忆较模型组得到了更大程度的改善。由此可见，通督调神灸可以有效改善MCAO大鼠的学习记忆能力。中医学认为卒中后学习记忆障碍本质为脏腑气血不足以致脑髓不充，或因痰湿、瘀血、肝阳等上扰“元神”，使其受损而发病。督脉是汇聚全身精、神、气，并交通心肾、统帅经络而循行入脑的一条经脉，百会穴是督脉中最常用于健脑清窍的穴位[16]。艾灸可加强局部刺激，利于激活穴位精气，故当艾灸作用于百会穴后可达到温通经络、化瘀散结、通调髓海之功效，从而改善学习记忆功能[17]。

3.3 通督调神灸可抑制MCAO大鼠神经元凋亡，抑制Cofilin活性，促进神经元轴突再生

卒中发生后，梗死区域的脑组织神经元受到损害后，梗死核心区的神经元会立即发生细胞坏死，而缺血半暗带的神经元会延迟数小时或数天后才开始出现凋亡。而细胞凋亡可以通过一些治疗手段的抑制而被逆转，因此，及时挽救缺血半暗带受损神经元，抑制其细胞凋亡可减少缺血缺氧对于神经元的损害，对改善脑卒中患者的神经功能和预后尤为重要[18，19]。同时，脑缺血缺氧发生后，缺血半暗带的受损神经元会离断成两部分，包括与胞体相连的近端残端及远离胞体的远端残端，近端残端轴突可通过发芽再生后朝着远端轴突方向生长，进而与附近神经元重新建立连接[20]。相关研究显示，Cofilin是海马神经元轴突生长的必要条件之一，学习记忆功能的产生和维持依赖于肌动蛋白的动态组装及Cofilin磷酸化水平的增加[21，22]。相关研究显示，抑制Cofilin的活性可减少MCAO大鼠缺血半暗带Cofilin的线粒体易位，从而抑制脑缺血引起的神经元凋亡[23]。

GAP-43神经生长相关蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)是一种轴突相关蛋白，在神经元生长及突触形成过程中高度表达，它能够促进神经元轴突再生、维持突触可塑性并调节学习记忆相关信号的传递功能，是轴突再生的典型特征，并可作为反应神经生长状况的分子标志物[24，25]。GAP-43的表达水平在正常情况下很低，在脑缺血发生后，梗死区域存活的受损神经元由于负反馈机制出现反应性轴突再生，使得GAP-43表达水平升高；随着缺血缺氧时间的延长，受损神经元的损伤情况加重并出现凋亡，反应性轴突再生减弱，GAP-43表达水平便开始逐渐下降[26]。而相关研究显示，缺乏GAP-43会限制小鼠神经元轴突再生，使其脑组织无法重建，导致突触功能丧失，进而出现认知功能受损[27]。本研究结果显示，MCAO造模后的大鼠神经元凋亡率明显高于假手术组大鼠，且造模后的大鼠梗死侧海马GAP-43、Cofilin表达水平显著升高，说明脑缺血再灌注损伤导致大鼠脑部梗死灶神经元出现大量凋亡，同时在脑缺血发生后，梗死区域神经元出现了一定程度上的反应性轴突再生，神经元中的Cofilin被大量激活，这不仅会导致生长锥崩塌，当其进入线粒体后还会促使存活的受损神经元启动细胞凋亡程序，引起神经元大量凋亡，反应性轴突再生出现减弱。通督调神灸干预后大鼠的脑梗死区域神经元凋亡率与模型组相比出现明显的降低，梗死侧海马GAP-43表达水平升高，Cofilin表达水平降低。可见，通督调神灸确可改善MCAO大鼠的脑梗死区域神经元凋亡，抑制Cofilin活性从而促进轴突再生，进而改善MCAO大鼠的学习记忆功能。

总之，通督调神灸干预可改善MCAO大鼠神经功能缺损情况，减少脑梗死体积，抑制脑梗死区域神经元凋亡，同时抑制Cofilin表达，促进神经元轴突再生，促进学习记忆功能康复。但通督调神灸通过哪些途径影响Cofilin表达与轴突再生还有待进一步研究。