西伯利亚杏离体快繁体系的建立

王世鹏，高子荑，孙永强，陈建华，董胜君，刘权钢

(沈阳农业大学林学院/辽宁省森林培育重点实验室，辽宁 沈阳 110866)

西伯利亚杏(Prunus sibiricaL.)又名山杏，为蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物[1]，适生于我国温带、暖温带地区[2]。 西伯利亚杏是集生态、经济、社会效益于一身的优良乡土树种[3]，生态适应性强，能在干旱、瘠薄、寒冷、风沙大等恶劣条件下正常生长，具有防风固沙、涵养水源等改善生态环境的功能[4]；此外，杏仁富含丰富的蛋白质、维生素、苦杏仁苷等多种营养及药用成分，具有较高经济价值和药用价值[5]。 目前，我国西伯利亚杏种质资源开发和育种工作已取得很大进展，培育出了“山杏1 号”等一批高产、稳产新品种[6]。 但在实际生产中，西伯利亚杏一直处于自然落种的野生、半野生状态，苗木品质参差不齐，即使是人工经营的林地，也处于“有种就摘，有苗就栽”的粗放管理状态，经济效益并不可观，严重阻碍了西伯利亚杏产业的发展[3]。 因此，如何快速推广具有高产稳产特性的优良品种成为西伯利亚杏产业发展的当务之急。

组织培养技术作为一种成本低、效率高、生产周期短的无性繁殖技术，是种质资源收集与创新、良种工厂化育苗的有效手段[7]，已成为越桔属[8]、绣球属[9]、槭属[10]等经济林植物扩繁的重要手段，被广泛应用于种质资源保护、遗传育种和无性系苗木的商业化生产中。 组织培养技术与基因工程、原生质融合等育种方法紧密结合，在种质资源创新和新品种选育中发挥着越来越重要的作用[11]。 植物种子具有便于储藏、取材不受季节制约的优势[12]，近年来很多学者以香椿[13]、柳杉[11]、珙桐[14]等树木种子为初代培养材料获得无菌苗并建立了组培快繁体系。 目前关于杏组织培养方面的研究已有报道，主要以下胚轴、子叶、茎尖、叶片等作为外植体材料，进行组培幼化效果[15]、愈伤组织诱导[16]、不定芽诱导[17]和生根诱导[18]等研究。 总体而言，杏植株再生相对困难，受外植体类型、激素配比和培养条件等多种因素的制约[12]，目前缺乏相对高效、完善的离体快繁体系。

本研究以西伯利亚杏种子和茎段为外植体材料，利用GA3处理快速打破西伯利亚杏种子休眠机制，筛选适用于不同外植体的最佳消毒方法、种子无菌苗培养最适条件及茎段腋芽诱导、增殖、生根的最适培养基，以期建立西伯利亚杏种子和茎段离体快繁体系，为实现西伯利亚杏的规模化生产、加速良种化进程提供理论与技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

西伯利亚杏种子于2021 年6 月采自沈阳农业大学喀左县山杏国家林木种质资源保存库。 收集成熟果实，去除果肉，杏核清洗后在室温下风干2～3 d，经选种、净种后储存在4 ℃冰箱中备用。茎段采自沈阳农业大学科研基地10 a 生西伯利亚杏母树，6 月上旬采集生长良好的一年生枝条，用保鲜盒带回实验室备用。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒方法筛选 种子:选取饱满度一致的种子，去除核壳后用1.0 g/L GA3溶液浸泡6 h，然后流水冲洗1 h；在超净工作台中将其放入75%乙醇中消毒30 s，用无菌水冲洗3～4 次，再分别用2% NaClO、5% NaClO 和0.1% HgCl2进行灭菌处理，灭菌时间设置为8、10、12 min，共9 个处理。 浸泡过程中不断用玻璃棒轻微搅拌，使种子充分消毒。 消毒结束后用无菌水冲洗3 ～4 次，去除种皮，接种到MS 基本培养基中。 每个处理接种30 粒种子，重复3 次，14 d 后统计萌发率和污染率。

茎段:将茎段放置到烧杯内，流水冲洗1 h，在超净工作台中将其放入75%乙醇中用玻璃棒搅拌30 s，然后用无菌水冲洗3 次，再用0.1% HgCl2或2% NaClO 进行灭菌处理，灭菌时间设置为1.0、1.5、2.0 min；取出，用无菌水冲洗3 次，放置在无菌滤纸上吸干水分，然后将茎段剪成1 cm 长带有一个芽点的小段，接种到MS 培养基，每个处理接种30 个，重复3 次，14 d 后统计存活率和污染率。

1.2.2 种子无菌苗培养条件的优化 为了获得西伯利亚杏种子萌发和生长的最佳培养条件，分别设置不同基本培养基(MS、1/2MS、WPM)和不同浓度(0.5、1.0、1.5 g/L)GA3溶液处理。 每处理接种30 粒消毒种子，重复3 次。 置于(24±2) ℃组培室内进行遮光培养。 14 d 后统计种子萌发率，测量根长，称量根鲜重，然后将根放入玻璃培养皿中置于烘箱中，105 ℃杀青20 min，80 ℃烘干至恒重，称重。

1.2.3 茎段腋芽诱导 将消毒后的西伯利亚杏茎段接种到添加不同浓度IBA(0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L)的MS 启动培养基上，研究不同浓度IBA 对其腋芽诱导的影响。 每个处理接种40 个外植体，重复3 次。 接种后观察并记录腋芽生长状况，21 d 左右统计诱导率。

1.2.4 腋芽增殖培养 将启动培养基中诱导获得的长势一致且健壮的无菌西伯利亚杏芽苗分别接种到5 种增殖培养基上:MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA、MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA、MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA、WPM+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA、WPM+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。 每个处理接种40 个芽苗，重复3 次。 观察并记录幼苗生长状况，30 d 左右统计增殖系数。

1.2.5 生根培养 选择增殖培养获得的2 cm 左右丛生芽，剪取单芽接种至分别添加0.2、0.5、0.8 mg/L IBA 或NAA 的1/2MS 培养基中进行生根培养。 上述每处理接种10 个芽，重复3 次，接种后观察并记录幼苗生根状况，30 d 左右统计生根率。

1.3 数据处理与分析

使用Microsoft Excel 2021 软件进行数据的记录和整理；使用SPSS 26.0 软件进行统计分析。 计算公式如下:萌发率(%)＝(萌发种子数/接种种子数)×100；污染率(%)＝(污染外植体数/接种外植体数)×100；茎段腋芽诱导率(%)＝(萌发茎段数/接种茎段数)×100；增殖系数＝增殖芽数/接种芽数；生根率(%)＝(生根苗数/接种苗数)×100。

2 结果与分析

2.1 不同外植体的最佳消毒处理筛选

2.1.1 种子消毒 由表1 可知，不同消毒处理对西伯利亚杏种子萌发率和污染率具有显著影响。5% NaClO 消毒不同时间的污染率均为零，但种子萌发受到显著抑制，萌发率较低，且消毒时间越长萌发率越低。 2% NaClO 与5% NaClO 的消毒效果相比，种子的萌发率(≥80%)显著升高，尤以消毒10 min 的萌发率最高，达到91.67%，其次为消毒8 min，两者间差异不显著。 比较0.1%HgCl2和2% NaClO 的消毒效果发现，西伯利亚杏种子的萌发率均表现为随着灭菌时间的延长先升高后降低，灭菌10 min 的萌发率最高，分别为80.00%和91.67%。 综合分析，用2% NaClO 消毒10 min 对种子进行消毒的效果最佳。

表1 不同消毒处理对西伯利亚杏种子的消毒效果比较 %

2.1.2 茎段消毒 由表2 可知，2% NaClO 处理的茎段污染率整体高于0.1% HgCl2处理，且存活率整体低于0.1% HgCl2处理；随着处理时间的延长，两种消毒剂处理的茎段污染率均降低，而存活率均先升高后降低。 其中，0.1% HgCl2消毒1.5 min 处理(处理2)的茎段存活率最高，为61.67%，污染率为12.22%；0.1% HgCl2消毒2 min 处理的茎段污染率最低，为零，但存活率仅为27.78%，极显著低于处理2。 综上，茎段最佳消毒处理为0.1% HgCl2消毒1.5 min。

表2 不同消毒处理对西伯利亚杏茎段的消毒效果比较 %

2.2 不同浓度GA3、培养基类型对西伯利亚杏种子无菌苗培养的影响

2.2.1 不同浓度GA3对种子萌发和生长的影响不同浓度GA3对西伯利亚杏种子的萌发和生长有显著影响(表3)。 随着GA3浓度的升高，种子萌发率及根长、根鲜重、根干重均表现出先增长再降低的规律。 GA3浓度为1.0 g/L 时，种子萌发率最高，无菌苗长势最好，种子萌发率、根长、根鲜重、根干重分别为91.67%、29.93 mm、83.00 mg、9.67 mg，均显著高于其他处理。 综上，选用1.0 g/L GA3浸泡种子，对西伯利亚杏种子萌发和无菌苗生长的效果最好。

表3 不同浓度GA3对西伯利亚杏种子萌发和生长的影响

2.2.2 不同培养基类型对种子萌发与生长的影响 在明确最佳消毒方法和GA3浓度的基础上，进一步筛选最佳培养基类型。 结果表明，种子接种在MS 培养基上5 d 后开始萌动，长出下胚轴；接种在1/2MS 和WPM 培养基上的种子则均在8 d左右才有萌动反应。 由表4 可知，处理1(MS)的种子萌发率最高(91.67%)，极显著优于处理2(1/2MS)和处理3(WPM)，处理2 的种子萌发效果最差(31.67%)。 从无菌苗根的生长状况看，MS 培养基中无菌苗的根长、根鲜重和根干重极显著优于1/2MS 和WPM，分别达到29.93 mm、83.00 mg、9.67 mg。 综上，MS 培养基是最适合西伯利亚杏种子萌发与生长的培养基。

表4 不同培养基类型对种子萌发与生长的影响

2.3 不同浓度IBA 对西伯利亚杏茎段腋芽诱导的影响

不同浓度IBA 对西伯利亚杏茎段腋芽的诱导率达35.00%～85.83%，随着IBA 浓度的升高呈现先增加后降低的趋势(表5)。 其中，在0.2 mg/L IBA 处理下，腋芽诱导率最高(85.83%)且萌发早，接种6 ～9 d 芽点即开始萌动，至20 d 左右形成2～4 cm 小绿梢，叶片自然舒展，生长状况良好(图1A、B)。 IBA 浓度过高(＞0.2 mg/L)会导致腋芽诱导率显著降低，腋芽长势较差，节间不易伸长。 因此，西伯利亚杏茎段腋芽诱导的最佳IBA浓度为0.2 mg/L。

图1 西伯利亚杏腋芽诱导(A 和B)、增殖(C)和生根培养(D 和E)

表5 不同浓度IBA 对西伯利亚杏腋芽诱导的影响

2.4 不同基础培养基类型及激素浓度对腋芽增殖的影响

由表6 可以看出，当6-BA 浓度为0.5 mg/L时，西伯利亚杏腋芽的增殖系数较低，丛生芽叶片弯曲，节间无法伸长(图1C、图2A)。 当6-BA 浓度增至1.0 mg/L 时，腋芽的增殖系数显著增加，处理3(MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA)增殖系数较高，为3.68，丛生芽的叶片舒展，节间能够伸长(图2B)；处理5(WPM+0.1 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA)增殖系数最高，但丛生芽基部产生大量愈伤组织，叶片无法展开(图2C)。 综上，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA 为腋芽增殖的最适培养基。

图2 不同增殖培养基中丛生芽的生长状态

表6 不同基础培养基类型及激素浓度对腋芽增殖的影响

2.5 不同生长素种类及浓度对生根的影响

1/2MS 培养基添加不同浓度NAA 或IBA 均可以诱导生根。 从接种后3 d 起，添加NAA 处理的茎段基部处开始膨大形成愈伤组织，随着培养时间延长，愈伤组织不断增大增多；培养两周后，愈伤组织处开始有乳白色的根长出，但无侧根分化。 添加IBA 处理的茎段底端形成的愈伤组织量少，接种后7 d 底端就有乳白色的根长出，而且具有侧根；随着培养时间的延长，根系逐渐增长，无菌苗长势优于NAA 处理(图1D、E)。 添加0.5 mg/L IBA 生根率最高，为80.00%，极显著高于其他处理(表7)。 因此，西伯利亚杏最佳生根培养基为1/2MS+ 0.5 mg/L IBA。

表7 不同生长素种类及浓度对生根的影响

3 讨论与结论

外植体灭菌是体外再生的重要环节，直接影响再生体系的建立。 由于植物组织中存在的污染微生物不同，找到适当的消毒方法至关重要[19]。目前多采用NaClO、HgCl2、酒精等一种或多种消毒剂联合对外植体进行消毒。 宫惠[20]和杨超臣[13]等研究表明，HgCl2对种子具有毒害作用，用其进行种子消毒时会对细胞造成损伤，不利于种子萌发。 本试验也发现0.1% HgCl2对西伯利亚杏种子的消毒效果差于2% NaClO；以2% NaClO消毒10 min 的效果最佳，种子萌发率达到91.67%，污染率为零。 另外，外植体不同，其适宜的消毒剂种类和消毒方法也不尽相同。 本研究中，0.1% HgCl2对西伯利亚杏茎段的消毒效果明显优于2% NaClO，在粉花山杏茎段消毒研究中也得出相同的结论[21]。 原因可能是茎段外源菌较多，NaClO 难以清除，同时也说明茎段对短时HgCl2处理具有一定的耐受性[22]。

西伯利亚杏种子具有生理后熟性，具有较长的休眠期。 目前解除果树种子休眠主要采用沙藏低温层积法和外源激素处理[23]，其中施用外源激素所需时间较短且使用相对灵活。 已有研究表明，外源GA3在打破种子生理休眠和促进萌发方面具有重要作用[24-25]，适宜浓度的GA3能够促进楸树[26]和沙枣[27]种子萌发。 本试验利用GA3溶液浸泡打破西伯利亚杏种子休眠，在0.5～1.5 g/L范围内，GA3处理对西伯利亚杏种子萌发和生长表现出低浓度促进、高浓度抑制的规律，与在楸树[26]和沙枣[27]上的研究结果一致；以1.0 g/L GA3处理的种子萌发效果最好，同时促进了无菌苗的发育和根的生长。

培养基作为植物组织培养的营养基础，是决定组织培养成功与否的关键因素，需要根据不同的组培生产和试验目的、植物种类和培养部位等选择适宜的培养基。 MS 培养基无机盐含量较高，微量元素种类齐全、浓度较高；WPM 培养基不含锰和碘，钙、钾和硝态氮的含量高，适用于大多数木本植物的培养。 本试验选用WPM、1/2MS 和MS 培养基，不添加任何激素，以探究适合西伯利亚杏种子萌发和生长的基本培养基，结果发现MS较WPM 和1/2MS 更利于西伯利亚杏种子萌发和生长，这与王立科等[28]对野生黑果枸杞组培试验的结果相似，但与在铁皮石斛[29]和香椿[13]中的试验结果不同。 这可能是由于不同植物品种具有不同的遗传、生物和生态特征，影响了对营养物质的需求[30]。

通过茎段腋芽诱导直接获得无菌芽苗的方式能够实现植物离体快繁且遗传稳定[31]。 单独使用生长素可以促进腋芽直接萌发成芽[32]，在紫花槭[33]和元宝枫[34]的离体快繁中，适宜浓度的IBA对茎段腋芽诱导具有显著效果；但高浓度的IBA也会抑制腋芽的萌发[33]。 本研究发现IBA 对西伯利亚杏茎段腋芽诱导的影响显著，当IBA 浓度为0.2 mg/L 时诱导率最高。

不同植物品种增殖培养中使用的培养基类型及激素种类和浓度存在差异。 李属植物增殖培养中比较常用的激素组合为6-BA 与NAA 或IBA[35-36]。 如仁用杏品种‘围选1 号’和‘优一’腋芽增殖培养中以MS 为基本培养基，添加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA，获得了较好的增殖效果；而李、杏砧木品种‘St.Julien A’在WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA 中增殖系数高，且生长良好。本研究对不同浓度6-BA 与0.1 mg/L NAA 组合用于西伯利亚杏腋芽增殖时发现，在MS 培养基中，1.0 mg/L 6-BA 的增殖系数显著高于0.5 mg/L 6-BA，且丛生芽长势良好，节间能够伸长，叶片舒展，说明较高浓度的细胞分裂素与较低浓度的生长素组合可获得良好的增殖效果[10]；在WPM 培养基中，虽腋芽增殖系数高于在MS 培养基中，但丛生芽生长状况较差，基部产生大量愈伤组织，叶片无法展开。 所以MS 培养基更适合西伯利亚杏腋芽的增殖培养。

有效的生根诱导是建立西伯利亚杏离体快繁的重要前提[37]。 IBA 和NAA 是植物生根培养中最常用的生长素。 本研究发现，NAA 和IBA 均能诱导西伯利亚杏生根。 但在添加NAA 的生根培养基中，与培养基接触的茎段基部先长出愈伤组织，根从愈伤组织处长出且生根缓慢；而在添加IBA 的生根培养基中，不易产生愈伤组织，根系从茎段基部直接长出，生根效率高。 可见，IBA 对西伯利亚杏的生根效果优于NAA，与前人研究结论[36-39]相似。

综上，本试验通过对西伯利亚杏种子和茎段最佳消毒处理、种子无菌苗培养条件及茎段腋芽诱导、增殖和生根的组培体系研究，建立了西伯利亚杏种子和茎段无菌苗培养及快繁技术体系:西伯利亚杏种子采取75%乙醇30 s+2% NaClO 10 min 的消毒方式进行灭菌，用1.0 g/L GA3溶液浸泡6 h 后接种到MS 基本培养基上，种子萌发率高达91.67%；茎段用75%乙醇30 s+0.1% HgCl21.5 min 消毒，然后接种到腋芽诱导培养基(MS+0.2 mg/L IBA)上，腋芽诱导率达85.83%；30 d 时转接入腋芽增殖培养基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 上，增殖系数可达3.68；30 d 时转接入生根培养基(1/2MS+0.5 mg/L IBA)上，生根率可达80.00%。 本研究为西伯利亚杏遗传转化研究奠定了基础，对实现西伯利亚杏的规模化生产、加速良种化进程工作具有重要意义。