UPLC 法结合灰色关联度分析及化学计量学评价不同产地枳壳质量

屈彬清，刘隆基，杨婧潇，罗 堃，王元清，刘瑞连，3*，严建业，4*

（1.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208； 2.中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004； 3.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006； 4.湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心，湖南 长沙 410208）

枳壳为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，具有理气宽中、行滞消胀的功效［1］，主要栽培于江西、四川、湖南等省［2］。现代研究表明，枳壳主要含有黄酮类、香豆素、挥发油类、生物碱等成分［3］。以柚皮苷、新橙皮苷为代表的二氢黄酮化合物具有抗氧化、抗炎抑菌、改善肠胃动力障碍［4］等作用； 枳壳中柠檬烯等挥发油类具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等作用［5］； 枳壳中香豆素类成分对调节胃肠运动的乙酰胆碱酯酶有抑制作用［6］。2020 年版 《中国药典》 仅以柚皮苷、新橙皮苷的含量来控制枳壳的质量，不能反映其质量的全貌，有待进一步完善。

枳壳的含量测定多用HPLC 法［7-9］，该方法耗时长灵敏度较低，而UPLC 法具有更高的柱效，能大大缩短分析时间。灰色关联度分析法是根据因素之间发展趋势的相似或相异程度，衡量因素间关联程度的一种方法［10］，可充分利用较少的原始数据去挖掘规律，作为模糊系统研究手段已应用于中药药效评价［11］、炮制对谱效关系的影响研究［12-13］及不同产地和商品规格药材质量评价［14］等。化学计量学是利用数学、统计学方法系统研究化学测量值内涵的科学［15］。本实验首次将UPLC 法和灰色关联度分析、化学计量学结合起来对不同产地枳壳进行综合质量评价，以期为客观评价与控制枳壳的质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； XS205DU 十万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ5200DV 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； Option R7 utra AN 超纯水系统 （英国ELGA LabWater公司）。

1.2 试剂与药物 芸香柚皮苷 （批号MUST-16030408）、川陈皮素（批号MUST-16070901） 对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司； 柚皮苷（批号 10552-201301）、橙皮苷 （批号 10089-201203）、新橙皮苷（批号10477-201203） 对照品均购自南昌贝塔生物科技有限公司； 圣草次苷（批号13463-28-0）、新北美圣草苷（批号13241-32-2）、橙皮内酯（批号23971-42-8）、枸橘苷（批号14941-08-3）、甜橙黄酮（批号2306-27-6）、桔皮素（批号481-53-8）、橙皮油素（批号495-02-3）对照品均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；纯度≥98%。甲醇、乙腈为色谱纯； 其余试剂均为分析纯； 水为超纯水。

21 批枳壳样品来源信息见表1，经湖南中医药大学中药鉴定教研室龚力民副教授鉴定为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ACQUITY UPLC ® BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流动相10%甲醇（A） -乙腈 （B），梯度洗脱 （0 ～5 min，82% ～75% A； 5 ～10 min，75% ～40% A； 10 ～11 min，40% ～5%A； 11～12 min，5%A； 12～16 min，5% ～82%A）； 体积流量0.5 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长（0 ～1.5 min，318 nm； 1.5 ～2.8 min，285 nm； 2.8～5 min，300 nm； 5 ～6 min，325 nm； 6 ～7.8 min，285 nm； 7.8 ～10.35 min，330 nm；10.35 ～10.8 min，290 nm； 10.8 ～16 min，325 nm）； 进样量2 μL。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取各对照品适量，加甲醇稀释成分别含圣草次苷9.75 μg/mL、新北美圣草苷22.50 μg/mL、芸香柚皮苷108.00 μg/mL、柚皮苷450.00 μg/mL、橙皮苷32.12 μg/mL、新橙皮苷260.00 μg/mL、橙皮内酯21.45 μg/mL、枸橘苷52.50 μg/mL、甜橙黄酮7.80 μg/mL、川陈皮素16.00 μg/mL、桔皮素15.75 μg/mL、橙皮油素6.30 μg/mL 的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取枳壳粗粉（过2 号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL，称定质量，超声（200 W，40 kHz）提取45 min，取出，冷却至室温，称定质量，用甲醇补足减失的质量，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 取对照品、供试品、空白溶剂适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰分离度理想，显示了良好的专属性。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 线性关系考察 分别精密称取圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、橙皮油素对照品适量，混匀，加入甲醇稀释，得到一系列不同浓度的对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度试验 取同一份供试品溶液（S8），在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、橙皮油素峰面积RSD 分别为0.42%、0.18%、0.40%、0.42%、0.29%、0.43%、0.27%、0.26%、0.27%、0.30%、1.26%、0.22%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液（S8），于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、橙皮油素峰面积RSD 分别为1.09%、0.66%、1.25%、0.49%、1.42%、0.25%、1.29%、2.81%、1.88%、2.75%、1.88%、2.82%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取枳壳粗粉6 份（S8），按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、橙皮油素含量RSD 分别为0.37%、0.23%、0.59%、0.44%、0.22%、0.15%、0.79%、0.93%、1.41%、1.23%、1.37%、1.40%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的枳壳粗粉6 份（S8），每份0.25 g，精密称定质量，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入各对照品溶液适量，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、橙皮油素平均加样回收率 （RSD） 分别为98.38% （0.97%）、99.02%（0.49%）、99.38% （0.86%）、99.42% （1.20%）、98.94% （0.84%）、99.53% （0.73%）、98.91%（2.06%）、99.55% （1.81%）、99.31% （2.92%）、99.30% （2.72%）、98.34% （2.98%）、99.27%（2.96%）。

2.5 样品含量测定 按“2.3” 项下方法制备21批枳壳药材供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

2.6 灰色关联度分析

2.6.1 样品数据集的建立 以“2.5” 项下12 种成分为指标性成分，建立枳壳药材质量灰色模式识别数据集，结果见表4。

表4 样品数据集Tab.4 Samples datasets

2.6.2 原始数据规格化处理 设有n个样品，每个样品有m项评价指标，即组成评价单元序列｛Xik｝ （i＝1，2，3，……，n；k＝1，2，3，……，m； 本实验中n＝21，m＝12）。由于评价指标之间存在测试单位不统一的问题，因此，按照Yik＝Xik/Xk对原始数据进行规格化处理，结果见表5。公式中Yik为规格化处理后的数据，Xik为原始数据，Xk为n个样品第k个指标的均值。

2.6.3 关联度计算 用灰色关联度进行评价时，应选择其参考序列。设最优参考序列和最差参考序列分别为｛Xsk｝ 和｛Xtk｝ （k＝1，2，3，……，m）。设最优参考序列的各项指标是n个样品对应指标的最大值，即｛Xsk｝； 最差参考序列的各项指标是n个样品对应指标的最小值，即｛Xtk｝。按照Ysk＝Xsk/Xk、Ytk＝Xtk/Xk对原始数据进行规格化处理。按照计算各评价单元序列相对最优（差） 参考序列的差值，式中，Δmin＝min ｜Yik-Ysk｜，Δmax＝max ｜Yik-Ysk｜，ρ为分辨系数，一般取值 0.5。按照计算各评价单元相对于最优（差） 参考序列的关联度。评价单元序列同时相对于最优参考序列和最差参考序列按照计算各样品的相对关联度ri，并按ri大小排序，见表6。相对于最优参考序列的关联度ri（s）越大，同时相对于最差参考序列的关联度ri（t）越小，则相对关联度就越高，表明该评价单元序列越理想，为最佳评价单元； 根据相对关联度的大小对评价单元序列进行质量排序，相对关联度越高排序越靠前，说明样品的质量评价越高，ri排序结果可作为药材质量高低评价的依据。由表6 可知，关联度排名前的样品包括来源于湖南、四川、江西、重庆的样品，说明这4 个产地的样品质量较好，这与湖南、四川、江西为枳壳的主产地及道地产区相吻合其中，S20（四川合江） 的相对关联度最高，说明S20 在21批样品中综合质量最好； 而S15 （安徽合肥） 相对关联度最小，说明其综合质量差，说明产地因素对其有效成分综合影响较大。关联度排后的样品不仅来源于浙江、安徽等地，还有产自湖南益阳、江西九江、江西赣州、江西萍乡的样品，这说明同一省份不同地区的样品质量可能存在差异性。

表6 各样品相对关联度质量优劣排序Tab.6 Results for sequencing quality of the samples

2.7 化学计量学分析

2.7.1 聚类分析 对21 批枳壳样品采用SPSS 21.0 数据统计软件进行聚类分析，将21 批样品的12 种成分含量作为变量，聚类方法为组间联接，度量标准选择欧式平方距离，结果见图2。由此可知，当类间距离范围为20 ～25 时主要分为2 类，即S1～S9、S12、S14、S20 分为G1 组，S10 ～S11、S13、S15～S19、S21 为G2 组。

图2 聚类分析树状图Fig.2 Dendrograms of hierarchical cluster analysis

2.7.2 质量波动分析 为了探究各批次样品之间的质量波动性，依据文献引入参数P值［16-17］，对不同批枳壳药材质量进行评价，公式为，其中Ci表示给定化合物的含量，而i表示21 批枳壳的平均含量。P值越靠近1，各批间的一致性就越好。一般而言，当P值在0.75 ～1.25 的范围内是可以接受的［16-17］。由图3 可知，甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、橙皮油素、橙皮内酯含量波动范围较大，表明这些成分对枳壳的质量有较大影响。将质量波动分析的结果与聚类分析的结果相结合，发现5 种成分含量较低的样品被分为G2 组，而含量相对较高的样品被分在G1 组，与聚类分析结果一致。

图3 不同批样品12 种成分的Box-chart 图Fig.3 Box-chart diagram of 12 constituents in different batches of samples

3 讨论

3.1 指标成分选择 实验选取的12 种成分中10种为黄酮类（圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素）、2 种为香豆素类（橙皮内酯、橙皮油素），分别具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎活性和调节胃肠道及抗抑郁作用［5，18］。王慧等［5］在文献分析基础上筛选出枳壳中黄酮类化合物（柚皮苷、新橙皮苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素）、香豆素类化合物（水合橙皮内酯、橙皮内酯）、部分挥发油、生物碱等作为质量标志物。结合上述文献，在前期研究［7］的基础上，选取该12 种成分作为考察指标。

3.2 测定方法选择 本实验考察了柱温 （25、30、35 ℃）、体积流量（0.3、0.4、0.5 mL/min），结合分离度、色谱峰数目和峰形，最终确定柱温30 ℃、体积流量0.5 mL/min。再考察超声提取时间（30、45、60 min），发现超声提取45 min，样品中12 种成分提取相对完全，确定了样品提取时间。将单一对照品溶液经紫外分光光度计进行全波长扫描，结合样品的出峰顺序、分离度、色谱峰数目及峰形，确定了318 nm、285 nm （圣草次苷、新北美圣草苷、枸橘苷）、300 nm （芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）、325 nm （橙皮内酯、橙皮油素）、330 nm （甜橙黄酮、川陈皮素）、290 nm （桔皮素） 作为检测波长。

4 结论

2020 年版《中国药典》 规定枳壳中含柚皮苷不得少于4.0%，新橙皮苷不得少于3.0%，本实验中所有样品均符合药典标准。本实验采用灰色关联分析、聚类分析与质量波动分析相结合对不同来源枳壳中12 种成分进行综合评价，三者结果能够相互印证，聚类分析结果显示，将关联度排名前二的S20、S9 与排名相邻的第4 ～12 名的样品分为G1 组； 关联度排名靠后的第14 ～21 名的样品分为G2 组，显然结果是合理的； 而其中关联度排名分别为第3 名和第13 名的S19、S14 却分别分在了G2、G1 组； 通过质量波动分析发现，因为S19 中甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、橙皮油素、橙皮内酯含量远低于G1 组而被分在G2 组，而S14 中这5种成分含量较高被分在了G1 组； 质量波动分析进一步验证了前者的准确性，体现了灰色关联分析、聚类分析及质量波动分析三者相结合的优势。

本实验建立了UPLC 法测定枳壳中12 种成分含量，并运用灰色关联分析与聚类分析对不同产地的枳壳中12 种有效成分进行综合评价； 再通过质量波动分析进一步验证，可判断枳壳药材质量的优劣，为综合评价枳壳质量提供依据。