清肺抑火片质量评价

张 纯，陈叶青，金佩芬，俞 秀，金小燕，李建国，宋喆旎

（嘉兴市食品药品与产品质量检验检测院，浙江 嘉兴 314001）

清肺抑火片是以黄芩、大黄、栀子、桔梗、苦参、天花粉、知母、黄柏、前胡9 味中药为原料加工制成的中药复方制剂，具有清肺止嗽、降火生津等功效［1］，临床上用于治疗肺热咳嗽、痰延壅盛等症状，可有效缓解急性支气管炎患者临床症状，改善其肺功能［2-4］，并且对缓解与空气污染相关的呼吸道损伤也有一定作用［5-7］。目前，清肺抑火片执行标准为1990 年版《中华人民共和国卫生部药品标准》 中药成方制剂第二册（WS3-B-0418-90），检测项目仅包含性状、片剂通则，缺乏更有针对性的内容，无法全面反映药物整体质量，导致市场上其质量参差不齐。本实验根据实际检验中发现的问题结合现行标准，对清肺抑火片质量情况进行评价，以期建立更完善的手段来进一步提升该制剂质量标准，并为其市场监管提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695-2998 高效液相色谱仪，配置DAD 检测器（美国Waters 公司）； XS205DU型电子天平 （瑞士Mettler-Toledo 公司）； Mili-Q Reference 超纯水仪（德国Merck Millipore 公司）；KQ-800KDE 高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； 暗箱式紫外透射仪（上海宝山顾村电光仪器厂）； 薄层色谱板（德国Merck 公司）。

1.2 药物 清肺抑火片共39 批，源自浙江省11个地市抽检样品，编号S1 ～S39，其中S1 ～S16 生产厂家为修正药业集团股份有限公司（A 厂，批号 190312、180606、170410、190102、190407、190304、190405、171017、190203、190115、171219、171214、190107、190103、190501、190210），S17～S21 生产厂家为云南白药集团大理药业有限责任公司（B 厂，批号 DBA1901、DFA1805、DDA1905、DBA1902、DJA1805），S22 ～S23 生产厂家为大理白族自治州中药制药有限公司（C 厂，批号180634、180637），S24 ～S25 生产厂家为云南龙发制药股份有限公司 （D 厂，批号181201、180908、170636、190136、180853 ），S26～S28 生产厂家为云南腾药制药股份有限公司（E 厂，批号170636、190136、180853），S29 ～S39生产厂家为云南省曲靖药业有限公司（F 厂，批号181112、190101、180805、181206、181201、180810、180608、181001、180604、180606、181207）。

1.3 试剂 白花前胡乙素（批号111904-201804，纯度98.9%）、白花前胡甲素 （批号111711-201904，纯度99.4%）、芒果苷 （批号111607-201704，纯度98.1%）、汉黄芩素（批号111514-201605，纯度 90.3%）、芦荟大黄素 （ 批号110795-201609，纯度98.1%）、大黄素甲醚（批号110758-201616，纯度99.0%）、盐酸小檗碱（批号110713-201814，纯度86.7%）、黄芩素 （批号110595-201306，纯度97.8%）、大黄酚 （批号110796-201922，纯度99.4%）、大黄素 （批号110756-201512，纯度98.7%）、栀子苷 （批号110749-201919，纯度97.1%）、汉黄芩苷 （批号112002-201501，纯度98.8%）、黄芩苷 （批号110715-201821，纯度95.4%）、土大黄苷 （批号110794-201909） 对照品及黄芩 （批号120955-201810）、栀子（批号120986-201610）、大黄（批号120984-201202）、黄柏（批号121510-201707）、关黄柏（批号120937-201408） 对照药材均购自中国食品药品检定研究院； 新芒果苷 （批号ST00360120-3671，纯度98.0%）、千层纸素A （批号ST23660120-6907，纯度98.0%） 对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。乙腈为色谱纯（德国默克公司）； 其他试剂均为分析纯； 水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 标准项目检验 按现行标准进行检验，包括性状、重量差异、崩解时限、微生物限度，发现所有批次样品均符合规定，表观质量良好。但缺少药味组成、主要成分含量测定等重要检测项目，未能全面反映清肺抑火片真实质量，无法完全起到质量控制和评价作用。

2.2 TLC 定性鉴别 根据本品组方和工艺，对黄芩、栀子、黄柏、大黄等主要药材进行TLC 鉴别［8-9］，以评估该制剂投料的真实性。方中黄芩为君药，用量最大，也是最主要原料； 栀子、黄柏为臣药，是药效主要贡献者，针对可能存在的关黄柏代替黄柏投料问题，有必要进行相关检查［10］； 大黄为佐药，因常有伪品土大黄混入，而且2020 年版《中国药典》［11］规定大黄及其制剂不得检出土大黄特有成分土大黄苷，故也需加以考察。

2.2.1 黄芩 取本品粉末1 g，加30 mL 甲醇超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液； 取不含黄芩的阴性样品粉末1 g，同法制备阴性样品溶液； 取黄芩对照药材0.5 g，同法制备对照药材溶液，分别吸取5 μL，以乙酸乙酯-丁酮-醋酸-水（5 ∶10 ∶5 ∶3） 为展开剂，展开，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰，结果见图1。

图1 黄芩TLC 色谱图Fig.1 TLC chromatograms of Scutellariae Radix

2.2.2 栀子 取本品、不含栀子的阴性样品粉末适量，按“2.2.1” 项下方法分别制备供试品、阴性样品溶液； 取栀子对照药材0.5 g，按“2.2.1”项下方法制备对照药材溶液； 取栀子苷对照品适量，甲醇制成1 mg/mL 对照品溶液，分别吸取5 μL，以三氯甲烷-甲醇 （3 ∶1） 为展开剂，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰，结果见图2。

图2 栀子TLC 色谱图Fig.2 TLC chromatograms of Gardeniae Fructus

2.2.3 黄柏 取本品粉末1 g，加10 mL 甲醇加热回流提取15 min，滤过，滤液浓缩至5 mL，作为供试品溶液； 取不含黄柏的阴性样品粉末1 g，同法制备阴性样品溶液； 取黄柏、关黄柏对照药材各0.1 g，同法制备对照药材溶液； 取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对照品适量，甲醇制成0.5 mg/mL 对照品溶液，分别吸取5 μL，以正丁醇-冰醋酸-水（7 ∶1 ∶2） 为展开剂，展开，晾干，在紫外灯（365 nm） 下检视，结果见图3。

图3 黄柏TLC 色谱图Fig.3 TLC chromatograms of Phellodendri chinensis Cortex

2.2.4 大黄 取本品粉末0.6 g，加5 mL 甲醇超声处理10 min，滤过，作为供试品溶液； 取不含大黄的阴性样品粉末0.6 g，同法制备阴性样品溶液；取大黄对照药材0.5 g，同法制备对照药材溶液，分别吸取5 μL，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（12 ∶5 ∶0.1） 为展开剂，展开，晾干，在紫外灯（365 nm） 下检视，结果见图4。

图4 大黄TLC 色谱图Fig.4 TLC chromatograms of Rhei Radix et Rhizoma

2.2.5 土大黄苷 取土大黄苷对照品适量，甲醇制成20 μg/mL 对照品溶液，吸取它及“2.2.4”项下供试品、阴性样品、对照药材溶液各5 μL，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-水（10 ∶3 ∶0.2 ∶0.3） 为展开剂，展开，晾干，在紫外灯（365 nm） 下检视，结果见图5。

图5 土大黄苷TLC 色谱图Fig.5 TLC chromatograms of rhaponticin

2.3 HPLC 含量测定

2.3.1 溶液制备

2.3.1.1 对照品溶液 精密称取新芒果苷、芒果苷、芦荟大黄素、汉黄芩素、千层纸素A、白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为301.64、303.52、298.42、273.20、297.33、298.89、104.04 μg/mL 的对照品溶液1；精密称取盐酸小檗碱、黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为511.18、498.78、199.97、506.14、149.85 μg/mL的对照品溶液2； 精密称取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷对照品适量，甲醇制成质量浓度分别803.02、2 501.39、802.65 μg/mL 的对照品溶液3。

2.3.1.2 供试品溶液 取本品10 片，研细，精密称取粉末0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入20 mL甲醇，称定质量，超声 （350 W、40 kHz） 处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.3.1.3 阴性样品溶液 取缺黄芩、缺大黄、缺栀子、缺知母、缺黄柏、缺前胡的阴性样品各10片，按“2.3.1.2” 项下方法平行制备6 份溶液，即得。

2.3.2 色谱条件 Waters XBridgeTMC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～60 min，10% ～70%A； 60～65 min，70%A）； 体积流量1 mL/min；柱温30 ℃； 检测波长254、322 nm； 进样量10 μL。

2.3.3 系统适用性考察 分别精密量取“2.3.1”项下3 种对照品溶液0.5、1、2.5 mL，置于同一25 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，制成新芒果苷、芒果苷、栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、千层纸素A、大黄素、白花前胡甲素、大黄酚、大黄素甲醚、白花前胡乙素质量浓度分别为6.04、6.07、80.30、250.14、20.45、80.27、19.95、5.97、5.46、5.95、8.00、5.98、20.25、5.99、2.08 μg/mL 的对照品溶液4，精密吸取它及供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.3.2” 项色谱条件下进样测定，结果见图6。由此可知，供试品、对照品溶液对应色谱峰的理论塔板数均大于5 000，分离度均大于1.5，阴性无干扰。

图6 各成分HPLC 色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.1” 项下3种对照品溶液适量，甲醇制成系列质量浓度，在“2.3.2” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归，并以信噪比 （S/N） ＝3 为检测限，S/N＝10 为定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.5 方法学考察

2.3.5.1 精密度试验 取“2.3.1.2” 项下供试品溶液适量，在“2.3.2” 项色谱条件下进样测定6 次，测得新芒果苷、芒果苷、栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、千层纸素A、大黄素、白花前胡甲素、大黄酚、大黄素甲醚、白花前胡乙素峰面积RSD 分别为 0.75%、1.26%、0.88%、0.82%、1.04%、0.80%、1.75%、2.18%、0.99%、2.20%、1.04%、0.64%、0.90%、0.94%、1.25%，表明仪器精密度良好。

2.3.5.2 重复性试验 取本品适量，按“2.3.1.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3.2” 项色谱条件下进样测定，测得新芒果苷、芒果苷、栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、千层纸素A、大黄素、白花前胡甲素、大黄酚、大黄素甲醚、白花前胡乙素含量RSD 分别为1.87%、1.60%、1.81%、2.69%、2.23%、2.09%、2.37%、2.30%、2.32%、2.38%、1.91%、2.66%、1.69%、2.40%、1.56%，表明该方法重复性良好。

2.3.5.3 稳定性试验 取“2.3.1.2” 项下供试品溶液适量，于 0、2、6、12、24、36 h 在“2.3.2” 项色谱条件下进样测定，测得新芒果苷、芒果苷、栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、千层纸素A、大黄素、白花前胡甲素、大黄酚、大黄素甲醚、白花前胡乙素峰面积RSD 分别为0.52%、1.54%、2.96%、1.74%、1.45%、2.50%、1.73%、2.61%、2.69%、1.42%、1.83%、2.37%、0.59%、1.81%、1.87%，表明溶液在36 h 内稳定性良好。

2.3.5.4 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品6 片，每份0.1 g，加入对照品溶液（新芒果苷、芒果苷、栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、千层纸素A、大黄素、白花前胡甲素、大黄酚、大黄素甲醚、白花前胡乙素质量浓度分别为6.01、17.65、119.28、406.27、77.49、100.20、138.52、4.22、38.26、15.04、8.92、12.19、23.22、4.25、4.42 μg/mL） 5 mL，按“2.3.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，新芒果苷、芒果苷、栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、千层纸素A、大黄素、白花前胡甲素、大黄酚、大黄素甲醚、白花前胡乙素平均加样回收率分别为98.48%、101.09%、100.96%、102.34%、99.21%、98.08%、102.97%、101.17%、101.41%、102.40%、98.46%、100.20%、101.85%、98.53%、99.82%，RSD 分别为 0.86%、1.74%、1.58%、0.63%、1.47%、1.08%、1.17%、0.99%、1.05%、0.59%、0.60%、2.08%、1.03%、1.10%、1.94%。

2.3.6 样品含量测定 取39 批样品，按“2.3.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.2” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 讨论

药物中成分种类、含量会直接影响其有效性、安全性，故中药成分分析是其质量控制的重要模式和方法之一［12］。本实验从TLC 定性鉴别、主要成分含量测定2 个方面对清肺抑火片进行质量评价，发现F 厂10 批样品未显示与黄芩对照药材一致的主斑点，而C、F 厂样品中黄柏药味主斑点较淡，可能存在黄芩、黄柏质量较差或投料不足的情况；不同厂家、批次样品中各成分含量差异显著，存在过低或未检出现象，如F 厂11 批样品中仅有4 批检出黄芩苷，而且含量较低，同时均未检出白花前胡甲素、白花前胡乙素。由此推测，清肺抑火片生产过程中可能存在以下主要质量问题： （1） 投料不足或低质投料； （2） 药材提取工艺不规范，药味主要成分转移率低； （3） 药材投料批间质量均一性较差。

本实验所测的15 种成分涉及清肺抑火片中知母等6 味主要药材，其中新芒果苷、芒果苷为知母主要活性物质［13-14］，栀子苷为栀子主要活性物质［15］，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A 为黄芩主要活性物质［16-17］，盐酸小檗碱为黄柏主要活性物质［18-19］，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为大黄主要活性物质［20-21］，白花前胡甲素、白花前胡乙素为前胡主要活性物质［22］。另外，在单波长下同时检测出13种成分，而在双波长下同时检测出15 种成分。

4 结论

本实验建立清肺抑火片中黄芩、栀子、黄柏、大黄的TLC 定性鉴别方法，其简便高效，节能环保，而且分离度、重复性良好； 建立新芒果苷、芒果苷、栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、千层纸素A、大黄素、白花前胡甲素、大黄酚、大黄素甲醚、白花前胡乙素的HPLC 含量测定方法，其操作简便，高效经济，可从多角度实现对该制剂的质量控制，为其科学监管提供技术参考。针对发现的问题，本实验建议对清肺抑火片现行质量标准进行修订，增加黄芩、栀子、黄柏、大黄的TLC 鉴别项目，以及芒果苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄酚、白花前胡甲素等主要成分的含量测定项目，从而确保该制剂质量的有效性、稳定性。