HPLC 法同时测定除湿防疫颗粒中11 种成分

隋欣彤，董 欣，胡力铭，王仁广，李小欢，王淑敏

（长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117）

除湿防疫颗粒是一种中药复方制剂，由黄芩、赤芍、连翘、当归、生地黄、生黄芪、黄连、黄柏、芦根、生薏苡仁、桃仁、冬瓜子、浙贝母、知母组成，具有清热解毒、止咳平喘功效，以清热药为主，清肺化痰药、补气血药为辅，共同作用于上焦，加强肺卫之气，抵御外邪。方中黄芩［1-2］、黄柏［3］、知母［4］、芦根［5］、赤芍［6］等为清热药，而黄芪［4］、浙贝［7］、冬瓜子［8］等为清肺补气血药。

中药复方制剂成分复杂多样，其作用往往是协同效应，故对多成分进行质量控制已成为相关研究的发展方向［9-12］。本实验采用HPLC 法同时测定除湿防疫颗粒中黄芩、赤芍、黄柏、黄连、桃仁、连翘、知母、黄芪、当归主要成分黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、芍药苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪，配置DAD检测器（日本岛津公司）； DE-100 型高速万能粉碎机（浙江红景天工贸有限公司）； AB135-S 型电子分析天平（十万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）； FD 中试冻干机［金西盟（北京） 仪器有限公司］； C21-SDHCB15 多功能电磁炉（浙江苏泊尔股份有限公司）； SB-4200DT 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试剂与药物 黄芩（产地山西）、赤芍（产地内蒙）、连翘（产地河南）、当归（产地甘肃）、生地黄（产地河南）、生黄芪（产地内蒙）、黄连（产地四川）、黄柏（产地四川）、芦根（产地河北）、生薏苡仁（产地贵州）、桃仁（产地河北）、冬瓜子（产地山东）、浙贝母（产地浙江）、知母（产地河北） 均购自安国市安兴中药饮片有限公司，经长春中医药大学药学院王淑敏教授鉴定为正品，符合2020 年版《中国药典》 相关规定。除湿防疫颗粒（自制，方法为取总药材183 g，加10 倍量水煎煮2 次，每次2 h，滤过，滤液冻干成粉末，加入乳糖、淀粉制粒，即得，每粒10 g，批号210402、210405、210408、210411、210414、210417）。苦杏仁苷（批号B20687）、黄芩素（批号B20571）、盐酸黄柏碱（批号B21437）、汉黄芩素（批号B20489） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司； 连翘苷（批号110821-201514）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号18031920） 对照品均购自中国食品药品检定研究院； 黄芩苷 （批号DSTDH002301）、盐酸小檗碱 （批号DST191113-009）、芒果苷 （批号DST190305-031）、阿魏酸（ 批 号 DST191022-001 ）、芍 药 苷 （ 批 号DSTDS007001） 对照品均购自成都德思特生物技术有限公司。乙腈为色谱纯； 其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridge BEH C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱，程序见表1； 体积流量1.0 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长210、230、258、280、330 nm； 进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 供试品溶液制备 取本品适量，粉碎成粉末，精密称取0.2 g，置于50 mL 锥形瓶中，精密加入20 mL 80% 甲醇，摇匀，称定质量，超声处理40 min，冷却至常温，80%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖、阿魏酸、汉黄芩素、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、盐酸黄柏碱、芒果苷、连翘苷、苦杏仁苷、芍药苷对照品适量，甲醇溶解并制成质量浓度分别为1、1、1、1、1、0.5、0.5、0.5、0.25、2、2 mg/mL 的溶液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按照处方工艺，分别制成缺黄芪、缺当归、缺黄芩、缺黄连、缺黄柏、缺知母、缺连翘、缺桃仁、缺赤芍的阴性样品，按“2.2” 项下方法制备，即得。

2.5 专属性试验 量取“2.2” “2.3 “ “2.4” 项下溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1～2。由此可知，各成分色谱峰均有良好的分离度，理论塔板数大于3 000，阴性样品溶液中除盐酸小檗碱以外的成分无干扰（黄连、黄柏含有盐酸小檗碱），表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

图2 阴性样品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of negative samples

2.6 线性关系考察 将“2.3” 项下对照品溶液中的盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素质量浓度稀释至0、2、4、8、16、32、64 μg/mL，芍药苷质量浓度稀释至0、5、10、20、40、80、160 μg/mL，黄芩苷质量浓度稀释至50、100、200、300、400、500、600 μg/mL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定3 次。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 精密吸取“2.3” 项下对照品溶液10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次，测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.69%、0.35%、0.86%、0.17%、0.84%、0.94%、0.76%、0.62%、0.45%、0.79%、0.83%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 取本品6 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD 分别为 0.51%、0.39%、0.29%、1.79%、1.22%、1.75%、1.31%、1.04%、1.55%、1.05%、0.35%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取同一份本品，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD 分别为1.29%、1.06%、1.00%、0.80%、0.38%、0.43%、1.48%、1.25%、1.23%、0.83%、1.05%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品 （批号210404） 6 份，每份0.1 g，按100%水平精密加入“2.3” 项下对照品溶液适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素平均加样回收率（RSD） 分别为 100.12% （0.95%）、102.04% （1.28%）、93.33% （1.41%）、104.03% （1.54%）、98.66%（1.88%）、96.99% （2.11%）、97.07% （0.68%）、100.86% （1.60%）、95.83% （1.38%）、101.50%（1.88%）、97.55% （1.79%）。

2.11 含量测定 取6 批样品，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，平行3 次，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验根据除湿防疫颗粒中各成分的理化性质，选择不同体积分数甲醇作为溶剂进行超声提取，并考察了不同超声时间的效果。结果，超声时间为40、50、60 min 时各成分含量均无明显差异，最终确定80% 甲醇超声处理40 min 作为供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件选择 本实验参考2020 年版《中国药典》［13］，比较甲醇-10 mmol/L 甲酸铵（氨水调pH 至8）、甲醇-5 mmol/L 磷酸二氢铵溶液等流动相的分离效果。结果，乙腈-0.1%磷酸作为流动相梯度洗脱71 min 时，各成分色谱峰峰形良好，基线平稳，分离度理想，理论塔板数均大于3 000。

3.3 检测波长选择 由于除湿防疫颗粒成分复杂多样，故本实验参考文献［1-8，14-21］ 报道，利用二极管阵列紫外检测器的优点，考察不同检测波长下色谱峰数目、分离度、峰面积。最终，采用“2.1” 项下多波长检测，此时各成分色谱峰均有较好的分离度，并且干扰较少。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定除湿防疫颗粒中黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素的含量，该方法简便准确，重复性好，可用于该制剂的质量控制。