HPLC 法同时测定除湿防疫颗粒中11 种成分

2023-11-23 10:57隋欣彤胡力铭王仁广李小欢王淑敏
中成药 2023年11期
关键词:毛蕊异黄酮小檗

隋欣彤,董 欣,胡力铭,王仁广,李小欢,王淑敏

(长春中医药大学药学院,吉林 长春 130117)

除湿防疫颗粒是一种中药复方制剂,由黄芩、赤芍、连翘、当归、生地黄、生黄芪、黄连、黄柏、芦根、生薏苡仁、桃仁、冬瓜子、浙贝母、知母组成,具有清热解毒、止咳平喘功效,以清热药为主,清肺化痰药、补气血药为辅,共同作用于上焦,加强肺卫之气,抵御外邪。方中黄芩[1-2]、黄柏[3]、知母[4]、芦根[5]、赤芍[6]等为清热药,而黄芪[4]、浙贝[7]、冬瓜子[8]等为清肺补气血药。

中药复方制剂成分复杂多样,其作用往往是协同效应,故对多成分进行质量控制已成为相关研究的发展方向[9-12]。本实验采用HPLC 法同时测定除湿防疫颗粒中黄芩、赤芍、黄柏、黄连、桃仁、连翘、知母、黄芪、当归主要成分黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、芍药苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸的含量,以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪,配置DAD检测器(日本岛津公司); DE-100 型高速万能粉碎机(浙江红景天工贸有限公司); AB135-S 型电子分析天平(十万分之一,瑞士Mettler-Toledo 公司); FD 中试冻干机[金西盟(北京) 仪器有限公司]; C21-SDHCB15 多功能电磁炉(浙江苏泊尔股份有限公司); SB-4200DT 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试剂与药物 黄芩(产地山西)、赤芍(产地内蒙)、连翘(产地河南)、当归(产地甘肃)、生地黄(产地河南)、生黄芪(产地内蒙)、黄连(产地四川)、黄柏(产地四川)、芦根(产地河北)、生薏苡仁(产地贵州)、桃仁(产地河北)、冬瓜子(产地山东)、浙贝母(产地浙江)、知母(产地河北) 均购自安国市安兴中药饮片有限公司,经长春中医药大学药学院王淑敏教授鉴定为正品,符合2020 年版《中国药典》 相关规定。除湿防疫颗粒(自制,方法为取总药材183 g,加10 倍量水煎煮2 次,每次2 h,滤过,滤液冻干成粉末,加入乳糖、淀粉制粒,即得,每粒10 g,批号210402、210405、210408、210411、210414、210417)。苦杏仁苷(批号B20687)、黄芩素(批号B20571)、盐酸黄柏碱(批号B21437)、汉黄芩素(批号B20489) 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司; 连翘苷(批号110821-201514)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号18031920) 对照品均购自中国食品药品检定研究院; 黄芩苷 (批号DSTDH002301)、盐酸小檗碱 (批号DST191113-009)、芒果苷 (批号DST190305-031)、阿魏酸( 批 号 DST191022-001 )、芍 药 苷 ( 批 号DSTDS007001) 对照品均购自成都德思特生物技术有限公司。乙腈为色谱纯; 其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridge BEH C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm); 流动相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脱,程序见表1; 体积流量1.0 mL/min; 柱温35 ℃; 检测波长210、230、258、280、330 nm; 进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 供试品溶液制备 取本品适量,粉碎成粉末,精密称取0.2 g,置于50 mL 锥形瓶中,精密加入20 mL 80% 甲醇,摇匀,称定质量,超声处理40 min,冷却至常温,80%甲醇补足减失的质量,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖、阿魏酸、汉黄芩素、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、盐酸黄柏碱、芒果苷、连翘苷、苦杏仁苷、芍药苷对照品适量,甲醇溶解并制成质量浓度分别为1、1、1、1、1、0.5、0.5、0.5、0.25、2、2 mg/mL 的溶液,即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按照处方工艺,分别制成缺黄芪、缺当归、缺黄芩、缺黄连、缺黄柏、缺知母、缺连翘、缺桃仁、缺赤芍的阴性样品,按“2.2” 项下方法制备,即得。

2.5 专属性试验 量取“2.2” “2.3 “ “2.4” 项下溶液适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图1~2。由此可知,各成分色谱峰均有良好的分离度,理论塔板数大于3 000,阴性样品溶液中除盐酸小檗碱以外的成分无干扰(黄连、黄柏含有盐酸小檗碱),表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

图2 阴性样品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of negative samples

2.6 线性关系考察 将“2.3” 项下对照品溶液中的盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素质量浓度稀释至0、2、4、8、16、32、64 μg/mL,芍药苷质量浓度稀释至0、5、10、20、40、80、160 μg/mL,黄芩苷质量浓度稀释至50、100、200、300、400、500、600 μg/mL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定3 次。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表2,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 精密吸取“2.3” 项下对照品溶液10 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次,测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.69%、0.35%、0.86%、0.17%、0.84%、0.94%、0.76%、0.62%、0.45%、0.79%、0.83%,表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 取本品6 份,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD 分别为 0.51%、0.39%、0.29%、1.79%、1.22%、1.75%、1.31%、1.04%、1.55%、1.05%、0.35%,表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取同一份本品,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素峰面积RSD 分别为1.29%、1.06%、1.00%、0.80%、0.38%、0.43%、1.48%、1.25%、1.23%、0.83%、1.05%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品 (批号210404) 6 份,每份0.1 g,按100%水平精密加入“2.3” 项下对照品溶液适量,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素平均加样回收率(RSD) 分别为 100.12% (0.95%)、102.04% (1.28%)、93.33% (1.41%)、104.03% (1.54%)、98.66%(1.88%)、96.99% (2.11%)、97.07% (0.68%)、100.86% (1.60%)、95.83% (1.38%)、101.50%(1.88%)、97.55% (1.79%)。

2.11 含量测定 取6 批样品,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算含量,平行3 次,结果见表3。

表3 各成分含量测定结果(mg/g,n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents (mg/g,n=3)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验根据除湿防疫颗粒中各成分的理化性质,选择不同体积分数甲醇作为溶剂进行超声提取,并考察了不同超声时间的效果。结果,超声时间为40、50、60 min 时各成分含量均无明显差异,最终确定80% 甲醇超声处理40 min 作为供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件选择 本实验参考2020 年版《中国药典》[13],比较甲醇-10 mmol/L 甲酸铵(氨水调pH 至8)、甲醇-5 mmol/L 磷酸二氢铵溶液等流动相的分离效果。结果,乙腈-0.1%磷酸作为流动相梯度洗脱71 min 时,各成分色谱峰峰形良好,基线平稳,分离度理想,理论塔板数均大于3 000。

3.3 检测波长选择 由于除湿防疫颗粒成分复杂多样,故本实验参考文献[1-8,14-21] 报道,利用二极管阵列紫外检测器的优点,考察不同检测波长下色谱峰数目、分离度、峰面积。最终,采用“2.1” 项下多波长检测,此时各成分色谱峰均有较好的分离度,并且干扰较少。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定除湿防疫颗粒中黄芩苷、芍药苷、盐酸小檗碱、苦杏仁苷、连翘苷、芒果苷、黄芩素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、盐酸黄柏碱、阿魏酸、汉黄芩素的含量,该方法简便准确,重复性好,可用于该制剂的质量控制。

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