萹蓄HPLC-ECD 指纹图谱建立与抗氧化活性评价

李 影，吴其妹，李志荣，邵起菊，陈荣祥*，周亚平*

（1.遵义医科大学药学院，贵州 遵义 563000； 2.遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义 563000）

萹蓄PolygonumaviculareL.为蓼科植物，其味苦、微寒，具有利尿，杀虫等功效［1］，主要含有黄酮类、酚酸类、苯丙素类等化学成分［2］，具有抗氧化、抑菌、抗动脉粥样硬化等药理活性［3-5］，能有效清除DPPH 自由基、抑制细胞衰老等，对小鼠皮肤的抗皱亦有显著作用［6-8］。

目前，萹蓄已被2020 年版 《中国药典》 收载，其质量优劣以杨梅苷含量（≥0.03%） 进行评价。中药成分复杂，仅靠单一或几种成分的测定难以反映其质量水平［9-11］。中药谱效关系是以中药指纹图谱为基础，通过与药效结合阐明药效物质基础，能较全面的评价中药质量［12］。在建立HPLC指纹图谱的常用检测方法中，电化学检测法（ECD） 具有特异性筛选药材中酚酸、黄酮等抗氧化活性成分的特点［13-15］，将其与HPLC 结合，可用以绘制中药“抗氧化指纹图谱”。中药指纹图谱结合谱效关系可进一步明确各化合物的贡献，灰色关联分析（GRA） 与偏最小二乘回归分析（PLSR）是较常见的分析方法［16］。GRA 可系统分析药效指标与指纹图谱共有峰的关联度，PLSR 可反映色谱峰与药效的正负关系及密切程度［17-18］。

因此，本研究采用HPLC-ECD 法筛查萹蓄抗氧化活性成分并建立指纹图谱，利用GRA 和PLSR分析探究萹蓄化学成分与抗氧化活性的关系，以期为萹蓄的质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Ultimate 3000 bio-RS 型高效液相色谱仪、1510 型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）； FE 28 型PH 计、ME104E/02 型万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； Purelab Chorus 2 型纯水超纯水系统（英国Elga 公司）。

1.2 药物与试剂 没食子酸（批号H1817069，纯度≥98%）、原儿茶酸（批号K1717091，纯度≥97%）、香草酸（批号B1914116，纯度98%）、咖啡酸（批号H1505037，纯度98%）、绿原酸（批号 J1523050，纯度 98%）、杨梅苷 （ 批号D1522033，纯度98%） 对照品均购自上海阿拉丁生化科技公司； 原儿茶醛对照品（批号KSBEB12，纯度98%） 购自北京伊诺凯科技有限公司； 荭草苷对照品（批号M2490010，纯度99.45%） 购自上海安谱实验科技股份有限公司； 新绿原酸（批号19042305，纯度≥98%）、原花青素B2 （批号21032902，纯度 98.17%）、洋蓟素 （ 批号21062408，纯度 99.47%）、异荭草苷 （ 批号20052201，纯度 99.67%）、牡荆素 （ 批号21022209，纯度 98.36%）、萹蓄苷 （ 批号20070702，纯度 99.76%）、槲皮苷 （ 批号21032404，纯度98.63%） 对照品均购自成都普菲德生物技术有限公司； 儿茶素对照品（批号2NJZKHM，纯度＞97%） 购自梯希爱（上海） 化成工业发展有限公司； 表儿茶素对照品（批号C19PA491108，纯度≥97%） 购自北京谨明生物科技有限公司； 对香豆酸对照品（批号P03468，纯度≥98%） 购自上海阿达玛斯试剂有限公司； 甲醇、乙腈为色谱纯，2，2＇-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二铵盐（ABTS，批号E2018132，分析纯）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批号D915107，分析纯），均购自北京伊诺凯科技有限公司。

萹蓄采于2021 年5 月至6 月，经遵义医科大学孟令杰博士鉴定为正品，具体信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 将17 批样品在45 ℃下烘干后粉碎，过60 目筛，精密称取粉末1 g，加入30 mL 80% 甲醇，称定质量，40 kHz 超声提取30 min，80%甲醇补足减失的质量，9 000 r/min 离心4 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取没食子酸、原儿茶酸、香草酸、咖啡酸、绿原酸、杨梅苷、原儿茶醛、荭草苷、新绿原酸、原花青素B2、洋蓟素、异荭草苷、牡荆素、萹蓄苷、槲皮苷、儿茶素、表儿茶素、对香豆酸对照品适量，甲醇溶解并定容，制成质量浓度为1 mg/mL 的贮备液，在-20 ℃下保存备用，使用前用80% 甲醇稀释至所需质量浓度，即得。

2.3 色谱条件 XBridge BEH shield RP18 色谱柱（3.0 mm×150 mm，2.5 μm）； 流动相乙腈（A） -9.6 mg/mL 柠檬酸溶液（pH 2.74，B），梯度洗脱（0～15 min，2.5% ～7%A； 15 ～20 min，7% ～14%A； 20～40 min，14% ～25%A； 40 ～48 min，25% ～80%A； 50 ～55 min，80% ～2.5%A）； 体积流量0.6 mL/min； 柱温45 ℃； 样品盘温度8 ℃； 检测电压650 mV； 进样量2 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取“2.1” 项下同一份供试品溶液（S9），在“2.3” 项色谱条件下进样测定6 次，以杨梅苷（19 号峰） 为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.4%，相对峰面积RSD 均小于2.1%，表明该方法精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取“2.1” 项下同一份供试品溶液（S9），室温下于0、4、8、12、16、24 h在“2.3” 项色谱条件下进样测定，以杨梅苷（19号峰） 为参照峰，测得各共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.5%，相对峰面积RSD 均小于4.2%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取同一份萹蓄粉末（S9），按“2.1” 项下方法平行制备供试品溶液6份，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，以杨梅苷（19 号峰） 为参照峰，测得各共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.7%，相对峰面积RSD 均小于3.1%，表明该方法重复性良好。

2.5 HPLC-ECD 指纹图谱建立

2.5.1 图谱生成 取17 批样品，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，将相关数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版） 软件，由中位数法得到指纹图谱及对照指纹图谱，共确认26 个共有峰，见图1～2。萹蓄指纹图谱与对照指纹图谱的相似度结果见表2，可知均≥0.944，表明各批样品成分相似，质量较为稳定。

图1 17 批样品HPLC-ECD 指纹图谱Fig.1 HPLC-ECD fingerprints for seventeen batches of samples

图2 萹蓄对照指纹图谱Fig.2 Reference fingerprint for P.aviculare

表2 17 批样品相似度评价结果Tab.2 Similarity evaluation results of seventeen batches of samples

2.5.2 共有峰指认 共指认出18 个共有峰，分别为1 号峰（没食子酸）、2 号峰（原儿茶酸）、3 号峰（原儿茶醛）、4 号峰（新绿原酸）、5 号峰（香草酸）、6 号峰（儿茶素）、7 号峰（咖啡酸）、8号峰（绿原酸）、10 号峰（表儿茶素）、11 号峰（原花青素B2）、12 号峰（对香豆酸）、14 号峰（洋蓟素）、15 号峰（荭草苷）、16 号峰（异荭草苷）、17 号峰（牡荆素）、19 号峰（杨梅苷）、20号峰（萹蓄苷）、21 号峰（槲皮苷），色谱图见图3。

图3 对照品HPLC-ECD 色谱图Fig.3 HPLC-ECD chromatogram of reference substances

2.6 偏最小二乘法判别分析（PLS-DA） 为研究产地间差异，将17 批样品按照产地分为4 组，并将26 个共有峰的相对峰面积导入SIMCA-14.1 软件进行PLS-DA 分析，测得R2X值为1，R2Y值为0.995，Q2值为0.727，三者均大于0.5，表明该模型的拟合和预测能力较好，见图4。由此可知，不同地区各批样品之间较靠近，而不同省份之间的差异较大。

图4 17 批样品PLS-DA 得分图Fig.4 PLS-DA score plot for seventeen batches of samples

2.7 总酚含量测定 参考文献［19］ 报道，取“2.1” 项下供试品溶液400 μL （用80%甲醇稀释40 倍），与400 μL 福林酚溶液（23.5 mg/mL） 混合后反应3 min，加入800 μL 15% Na2CO3溶液，反应混合物于暗处保持30 min 后，在760 nm 波长处测定吸光度。以没食子酸为对照品绘制标准曲线，计算含量，结果见表3。由此可知，不同批样品中总酚含量较高，在10.1～20.0 mg/g 范围内。

表3 总酚含量及抗氧化活性测定结果Tab.3 Results of total phenol content and antioxidant activity determination

2.8 抗氧化活性研究

2.8.1 DPPH 自由基清除能力 参考文献［20］报道，取“2.1” 项下供试品溶液70 μL （用80%甲醇稀释90 倍），与30 μL 80% 甲醇混匀后加入200 μL DPPH，作为样品组，以80% 甲醇为空白组，暗处反应10 min 后在517 nm 波长处测定吸光度（A），样品组、空白组的吸光度分别以As、Ao表示，重复3 次，计算清除率，公式为清除率＝［（Ao-As） /Ao］ ×100%。

2.8.2 ABTS 自由基清除能力 参考文献［21］报道，ABTS 试剂由K2S2O8（0.67 mg/mL） 与ABTS （3.75 mg/mL） 等体积混合并于室温暗反应12 h，稀释至吸光度为0.8±0.02。取“2.1” 项下供试品溶液100 μL （用80%甲醇稀释40 倍），与200 μL ABTS 混匀，作为样品组，再以80%甲醇为空白组，室温下保持30 min 后，在734 nm 波长处测定吸光度（A），样品组、空白组吸光度分别以As、Ao表示。重复3 次，计算清除率。

2.8.3 铁离子还原能力 参考文献［22］ 报道，将体积比为1 ∶1 ∶10 的FeCl3水溶液（5 g/L）、TPTZ （3 mg/mL，用1.46 mg/mL 盐酸配制）、醋酸钠缓冲液 （pH 3.6，40 mg/mL） 混合，作为TPTZ 工作液。取 “2.1” 项下供试品溶液 （用80%甲醇稀释75 倍），与300 μL TPTZ 工作液混合，室温静置10 min 后在593 nm 波长处测定吸光度，在相同条件下测定不同浓度奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox） 吸收值，并绘制标准曲线，FRAP 结果以Trolox 当量表示。

2.8.4 结果分析 表3 显示，不同批样品抗氧化活性差异较大，DPPH 自由基清除率在38.2% ～77.9%范围内，ABTS 自由基清除率在26.7% ～99.8%范围内，FRAP 值在25.0 ～53.0 mg/g 范围内。再将总峰面积同总酚含量、DPPH 自由基清除活性、ABTS 自由基清除活性及FRAP 进行相关性分析，可知总峰面积与总酚及抗氧化活性间的相关系数≥0.855，见表4。

表4 总峰面积、总酚含量、抗氧化活性的相关性分析Tab.4 Correlation analysis between total peak areas，total phenol contents and antioxidant activities

2.9 谱效关系研究

2.9.1 灰色关联度分析 以抗氧化活性指标为参考序列，共有峰峰面积为比较序列进行分析，r为各参考序列与比较序列之间的灰色关联系数的均值（即关联度），其数值越大，则对抗氧化的贡献越大［23］，结果见表5。由此可知，26 个共有峰所对应的化学成分与DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力的关联度均大于0.8，关联度较高；除4 号峰（新绿原酸） 外，其余25 个共有峰所对应的化学成分与FRAP 的关联度均大于0.8。综上所述，对抗氧化能力贡献较大的共有峰为10 号峰（表儿茶素）、3 号峰（原儿茶醛）、12 号峰（对香豆酸）、9 号峰、11 号峰（原花青素B2）、16 号峰（异荭草苷）、24 号峰、6 号峰（儿茶素）、14 号峰（洋蓟素）、15 号峰（荭草苷）、25 号峰、1 号峰（没食子酸）、19 号峰（杨梅苷）、2 号峰（原儿茶酸）、23 号峰、21 号峰（槲皮苷）、20 号峰（萹蓄苷）。

表5 灰色关联度分析结果Tab.5 Results of grey relational analysis

2.9.2 偏最小二乘回归分析（PLSR） 以FRAP值、DPPH 自由基清除活性、ABTS 自由基清除活性为因变量，共有峰峰面积为自变量，将量化数据导入SIMCA-14.1 软件进行分析，标准化回归系数为正，则表共有峰与抗氧化活性呈正相关，反之为负相关； 变量重要性投影（VIP） 值＞1 时，共有峰对抗氧化活性有显著贡献［24］，结果见图5。由此可知，3 号峰（原儿茶醛）、6 号峰（儿茶素）、10 号峰（表儿茶素）、11 号峰（原花青素B2）、12 号峰（对香豆酸）、14 号峰（洋蓟素）、16 号峰（异荭草苷）、19 号峰（杨梅苷）、20 号峰（萹蓄苷）、21 号峰（槲皮苷）、9 号峰、13 号峰、23号峰、24 号峰、25 号峰的VIP 值均大于1，而且均为正值，表明它们与抗氧化活性呈高度正相关，并与灰色关联度分析结果基本一致。

图5 PLSR 标准化回归分析Fig.5 Standardization regression analysis of PLSR

3 讨论

萹蓄中的主要抗氧化成分为酚酸、黄酮类化合物，较低pH 的流动相有利于这些化合物的分离［25］。同时，适量的缓冲盐可以降低ECD 的背景噪音并保护工作电极，因此本研究采用柠檬酸作为流动相的添加剂，一方面在于柠檬酸在有机溶剂中的溶解性较好，另一方面在于柠檬酸缓冲溶液在较低的pH 值下有较强的缓冲能力。采用9.6 mg/mL柠檬酸溶液和乙腈作为流动相，并利用NaOH 溶液调节柠檬酸溶液的pH 值。结果发现，当pH 值小于3 时，色谱峰分离度与峰形较好，而pH 值过低则导致ECD 响应降低，故最终确定以9.6 mg/mL柠檬酸溶液（NaOH 溶液调节pH 为2.74） 和乙腈作为流动相。在优化流动相的基础上，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，依据“2.3” 项色谱条件下进样，每隔50 mV 进样1 次，考察萹蓄化学成分在50～750 mV 电压范围内的响应情况，以确定最优电压。当电压小于650 mV 时，各成分的信号响应随电压的增大而增大，而在650～700 mV 时大部分化合物的信号响应已趋于平缓，综合考虑，确定以650 mV 作为最佳检测电压。

本研究所采集的萹蓄来自4 个不同的产地，不同批次萹蓄间的化学成分和抗氧化活性均有较大差异。为研究不同产地间的萹蓄差异，对17 批样品进行PLS-DA 分析，结果发现同一产地的萹蓄之间较为相近，但不同省份间的差异较大。这可能与不同产地间的气候条件、生态系统差异较大，对药用植物次生代谢物的影响较大有关［26］。较为特殊的是河南省的5 批样品，彼此间的差异较大，这可能是由S15 和S16 与其他萹蓄的采集时间不同所致。该结果说明，产地和采集时间均影响萹蓄药材的质量。

现有研究证实，萹蓄具有良好的抗氧化作用，但有关其具体的抗氧化成分研究较少。由于中药的成分组成较为复杂，采用常规的分离、纯化单体化合物的方法来筛查抗氧化成分难度较大。基于ECD 可特异性检测酚类等还原性化合物的原理，本研究采用HPLC-ECD 法建立萹蓄指纹图谱，进一步对萹蓄色谱图总峰面积同总酚含量、DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 进行相关性分析发现，相关系数均大于0.855，即HPLC-ECD 色谱峰面积与抗氧化活性呈高度正相关，与其他药用植物抗氧化的研究结果相一致［27-28］。

为深入探究萹蓄指纹图谱共有峰与抗氧化活性之间的关联性，进一步对萹蓄指纹图谱中的26 个共有峰与3 种抗氧化活性指标进行GRA 与PLSR分析。GRA 结果显示，除4 号峰（新绿原酸） 外，其余共有峰与抗氧化活性的关联度均在0.8 以上，表明萹蓄发挥抗氧化活性为多种成分协同作用的结果。经PLSR 分析发现，对抗氧化作用贡献较大的为3 （原儿茶醛）、6 （儿茶素）、9、10 （表儿茶素）、11、12 （对香豆酸）、14 （洋蓟素）、16 （异荭草苷）、19 （杨梅苷）、20 （萹蓄苷）、21 （槲皮苷）、23、24、25 号峰。9、23 ～25 号峰所代表的成分尚不清楚，后期可利用液质联用技术对以上4种未知成分及其他成分进行指认，从而为萹蓄抗氧化物质的揭示提供依据。