UPLC 法同时测定五味子糖浆中7 种成分

赵 硕，张金朋，赵志远，陈玉凤，郭晓帆，刘媛媛

［山东第一医科大学（山东省医学科学院） 药学院，山东 泰安 271016］

五味子糖浆是五味子经浸渍、渗漉等过程制成的中药制剂［1］，具有补气生津、补肾安神功效［2］，常用于治疗慢性咳嗽、气短、心悸、失眠等症状［3-4］，2020 年版《中国药典》 一部“含量测定”项下以五味子醇甲为定量指标［5］，不能全面反映该制剂整体质量，在临床应用方面存在很大局限性。前期报道，五味子产地、采收期、加工方式不同可能会导致相关制剂的质量或安全问题［6-7］，故加强药材质量控制十分重要。迄今为止，关于五味子糖浆的含量测定已有文献［8-13］ 报道，但尚未采用UPLC 法同时测定五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素的含量，故本实验对其进行研究，以期为该制剂质量控制、临床应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 超高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号Nexera X2）； 德安特电子分析天平（0.1 mg，天津德安特传感技术有限公司，型号ES-E120A）；高速冷冻离心机［赛默飞世尔科技（中国） 有限公司，型号Fresco 21］； 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-600DB）； 纯水机（德国默克公司，型号Direct-Q®8UV-R）。

1.2 试剂与药物 五味子醇甲（批号D1827017，纯度≥98%）、五味子醇乙（批号F1508140，纯度≥98%）、五味子甲素 （批号D1911039，纯度≥98%） 对照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 戈米辛J （批号G99633663，纯度≥98%）、当归酰戈米辛H （批号A43133661，纯度≥98%）对照品（上海吉至生化科技有限公司）； 当归酰戈米辛Q 对照品（北京中科质检生物技术有限公司，批号PCS-210329，纯度≥98%）； 五味子酚对照品（上海麦克林生化科技有限公司，批号C12256480，纯度≥98%）。五味子糖浆（湖北端正药业股份有限公司，批号211101、210102、201102、220501、220301、201501）。甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20210331）； 乙腈为色谱纯（安徽天地高纯溶剂有限公司，批号19115052）；甲酸为质谱纯［赛默飞世尔科技（中国） 有限公司，批号214053］。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Ultimate ® UHPLC XB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流动相水（含0.1%甲酸） （A） -乙腈（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脱（0～1.2 min，45% ～53%B； 1.2～3 min，53% ～53.5%B； 3～10 min，53.5% ～55%B； 10 ～13 min，55% ～95% B； 13 ～15 min，95% ～95% B； 15 ～17 min，95% ～45%B； 17～21 min，45% ～45%B）； 体积流量0.3 mL/min； 柱温40 ℃； 检测波长267 nm； 进样量3 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得到质量浓度分别为1 252、154、375、259、258、102、375 μg/mL 的贮备液，分别精密吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得（各成分质量浓度分别为五味子醇甲125.20 μg/mL、戈米辛J 15.40 μg/mL、五味子醇乙37.50 μg/mL、当归酰戈米辛H 25.90 μg/mL、当归酰戈米辛Q 25.80 μg/mL、五味子酚10.02 μg/mL、五味子甲素37.50 μg/mL），置于4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 供试品溶液 精密吸取2 mL 本品，置于15 mL 离心管中，4 倍量80%甲醇稀释，超声（功率540 W） 提取20 min，80% 甲醇补足减失的质量，12 000 r/min 离心5 min，取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照处方工艺，制成缺五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取“2.2” 项下对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中各成分保留时间与对照品溶液中的一致，分别为3.867、4.332、4.600、5.971、6.622、9.435、13.186 min，而且相邻峰之间的分离度均大于1.5，表明该方法专属性良好。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，甲醇依次稀释1.25、2、5、50、500 倍，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标 （X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.3.2” 项下对照品溶液（含五味子醇甲25.04 μg/mL、戈米辛J 3.08 μg/mL、五味子醇乙7.50 μg/mL、当归酰戈米辛H 5.18 μg/mL、当归酰戈米辛Q 5.16 μg/mL、五味子酚2.04 μg/mL、五味子甲素7.50 μg/mL）适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素峰面积RSD 分别为0.41%、1.15%、0.34%、0.54%、1.32%、1.17%、0.36%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 精密吸取同一份本品（批号211101），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素含量RSD 分别为1.61%、1.21%、1.21%、1.25%、1.73%、1.88%、1.14%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、当归戈米辛H、当归戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素峰面积RSD 分别为0.59%、1.51%、0.89%、1.69%、1.98%、1.78%、1.11%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密吸取各成分含量已知的本品（批号211101） 9 份，每份1 mL，分为低、中、高剂量组，每组3 份，分别按50%、100%、150%水平加入对照品溶液，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素平均加样回收率分别 为 99.96%、99.41%、100.26%、100.51%、99.68%、99.18%、99.83%，RSD 分别为0.48%、0.68%、1.93%、0.76%、1.01%、1.07%、0.82%。

2.3.7 样品含量测定 精密吸取6 批样品，每批2 mL，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下各进样测定3 次，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（μg/mL，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （μg/mL，n＝3）

3 讨论

3.1 提取条件选择 前期报道，不同料液比、溶剂对成分含量测定具有一定影响［14］。本实验采用单因素试验分别对料液比（1 ∶1、1 ∶4、1 ∶9）、甲醇体积分数 （70%、80%、100%）、提取时间（10、20、30 min） 进行考察，结合提取率等指标，最终发现料液比1 ∶4 的80%甲醇超声提取20 min效果最好。

3.2 色谱条件选择 对于流动相的选择，考虑到五味子味酸，故本实验考察了水-乙腈、0.1%甲酸-0.1%乙腈体系［15-17］，发现前者洗脱时基线较稳定，但峰形有拖尾现象，故在上述两相中加入0.1%甲酸，此时峰形得到很好的改善，分离度也有所提高。

3.3 含量分析 表2 显示，五味子醇甲含量最高，在中药质量控制评价模式中，该成分作为五味子糖浆质量控制标准符合2020 年版《中国药典》 规定；五味子醇乙、五味子甲素、当归酰戈米辛H 含量次之，药理活性较强［18-19］，也可作为检测指标。

4 结论

本实验建立UPLC 法同时测定五味子糖浆中五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素的含量，该方法简便快速，稳定可靠，可用于该制剂全面质量控制和评价。