红树林沉积物产酶微生物的分离和鉴定

杜雅萍

(自然资源部第三海洋研究所,海洋生物遗传资源重点实验室,福建 厦门 361005)

红树林生长之地处于陆地与海洋的交汇,常年经受潮汐浸淹.厦门市集美区红树林以秋茄为主,根植于沿海滩涂一带,主要保护海岸带不受风浪侵蚀,也是厦门一道亮丽的风景线.红树林生态系统是异养微生物、营养物质、树和海洋生物紧密结合的有机体.红树林根的渗出液为很多细菌的生长和繁殖提供营养,细菌参与了红树林沉积物绝大部分的碳循环[1].因此,可以利用红树林环境的特殊性,从其沉积物中筛选具有产酶活性的菌株.木聚糖来源比较广泛,是植物细胞壁半纤维素的主要成分,包括植物组织、细菌、真菌和原生动物等[2].木聚糖酶在食品、饲料、工业等均有广泛应用[3-4].酸性果胶酶指内聚半乳糖醛酸酶,可无规则地水解果胶酸分子中的α-1,4糖苷键,目前已广泛应用于果蔬汁生产和果酒澄清领域.此外,在木质防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理等行业中也有着重要作用,是四大酶制剂之一[5].纤维素在自然界中分布广,占植物干重的35%～50%,是产量最多的碳水化合物资源[6-7].纤维素酶能把纤维素分子降解成葡萄糖,可有效避免浪费和污染,且适应温度和酸碱度范围较广,可应用于生物、食品、能源、纺织等领域[8].本研究试图从红树林生境中获取新颖的具有产酶活性的可培养微生物,获得的菌株用于酶制剂的开发利用.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 沉积物样品1份,来自于福建省厦门市集美区红树康桥公交站旁海边红树林根际土壤(经度:118.106 2、纬度:24.579 1),采集时间为2020年3月.

1.1.2 培养基 本研究采用3种酶筛选培养基,底物分别为木聚糖、纤维素和果胶.木聚糖富集培养基:木聚糖10.0 g/L,(NH4)2SO420.0 g/L,KH2PO42.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,pH值为7.2.羟甲基纤维素富集培养基:(NH4)2SO42.0 g/L,K2HPO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,NaCl 30.0 g/L,CMC-Na 15.0 g/L,pH值为7.2.果胶富集培养基:果胶10.0 g/L,Na2HPO45.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,pH值为4.5.木聚糖分离培养基:木聚糖10 g/L,(NH4)2SO420 g/L,KH2PO42.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,琼脂粉20.0 g/L,pH值为7.2.羟甲基纤维素刚果红分离培养基:K2HPO40.5 g/L,MgSO40.25 g/L,CMC 1.88 g/L,刚果红0.2 g/L,明胶2.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,琼脂14.0 g/L,pH值为7.2.果胶分离培养基:果胶5.0 g/L,Na2HPO45.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,琼脂20.0 g/L,pH值为4.5.纯化培养基为青岛海博2216E琼脂培养基.酶活验证培养基为2216E+底物配制琼脂培养基.

1.1.3 主要试剂和仪器 细菌基因组提取试剂盒(上海赛百盛),真菌基因组提取试剂盒(Magen),PCR相关试剂(北京全式金生物),其他试剂购自国药集团.IS-RDS4低温叠加式恒温振荡器(美国精骐有限公司),BiometraPCR仪(德国耶拿分析仪器有限公司),PICO 17微量高速离心机(美国Thermo Scientific),DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂),Tanon-2500凝胶成像分析仪(上海天能科技有限公司).

1.2 红树林沉积物可培养菌株的分离、鉴定、系统进化分析

1.2.1 细菌富集和分离 各取样品2 g,分别接种至装有50 mL木聚糖富集培养基、50 mL果胶富集培养基和50 mL纤维素富集培养基的三角瓶中,置于摇床,28 ℃,150 r/min富集培养.培养7 d后,分别取100 μL菌液,相应地转接到50 mL三角瓶的3种富集培养基中,置于摇床,28 ℃ 150 r/min进行第二次富集;待培养7 d后,再分别取100 μL菌液置于已装有900 μL无菌海水的离心管中,震荡混匀后,梯度稀释,最后选取10-4和10-5等2个稀释度涂布平板,进行细菌的第一次分离.培养7 d后进行第二次梯度稀释,取10-4、10-5、10-63个稀释度涂布平板采用10倍梯度稀释涂布平板法,进行细菌的第二次分离.获得单菌落后,采用四区划线法分离纯化,获得纯培养物.

1.2.2 菌株鉴定 菌株DNA参照上海赛百盛试剂盒说明书,按步骤提取.对于较难抽提的真菌菌株,用液氮冷冻研磨后再用真菌试剂盒提取[9].16S rRNA基因采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增,18S rRNA基因采用真菌通用引物ITS5F和LR6R进行PCR扩增,PCR产物送厦门铂瑞生物科技有限公司测序.

1.2.3 菌株多样性分析 所测基因序列经过多序列比对、去重复,提交EzBioCloud、NCBI等权威数据库比对,确定其分类地位.

1.3 红树林沉积物可培养菌株的产酶活性筛选和验证

运用改进的平板法,分别以可溶性淀粉、脱脂牛奶、三丁酸甘油酯、果胶、木聚糖、羧甲基纤维素钠为底物,在2216E培养基上分析红树林沉积物细菌产胞外淀粉酶、蛋白酶、脂酶(三丁酸甘油酯)、果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶的活性[10].

2 实验结果与分析

2.1 红树林沉积物可培养菌株的分离鉴定

从红树林沉积物样品中,共获得27株菌,通过16S rRNA和18S rRNA基因测序剔除重复,菌株可分为18株细菌、3株酵母和6株丝状真菌,其活性及分类地位如表1所示,所有菌种保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC).

2.2 红树林沉积物中筛选可培养菌株的多样性分析

红树林沉积物菌株的多样性分析表明:18株细菌分别属于γ-变形菌纲(11株,69%),放线菌纲(高G+C革兰氏阳性菌)(5株,19%),拟杆菌纲(2株,12%)3大类群.18株细菌可分为13个属的16个种(表1),具有较高多样性.菌株数量较多的8个属为γ-变形菌纲中的Oceanimonas(2株)、Vibrio(2株)、Pseudomonas(2株)、Celerinatantimonas(1株)、Pseudoalteromonas(1株)、Mangrovibacter(1株)、Klebsiella(1株)、Pantoea(1株);5株放线菌纲分别属于Curtobacterium(2株)、Isoptericola(1株)、Gordonia(1株)、Leifsonia(1株)4个属;拟杆菌纲为1个属Algoriphagus(2株).

这18株细菌与近缘模式菌株一起构建Neighbour-Joining系统进化树见图1.9株真菌包含3株酵母,5株丝状真菌,1株毛霉菌门(Mucoromycota)毛霉亚门(Mucoromycotina)菌株.其中,3株酵母属于酵母亚门(Saccharomycotina),5株丝状真菌属于盘菌亚门(Pezizomycotina).这9株真菌与标准数据库菌株一起构建系统发育树见图2.同时,分离得到的18株细菌包含2株潜在新种(16S rRNA基因的相似度低于98.65%),9株真菌包含2株潜在新种(18S rRNA基因的相似度低于98%).结果表明:本实验分离到的红树林沉积物菌株多样性十分丰富,且潜在新种的基因新颖有较高的研究价值.

图1 可培养细菌单菌与模式菌16S rRNA 基因系统进化树

图2 采用Neighbour-Joining法构建的9株真菌及对应相近菌株的系统进化树

2.3 红树林沉积物中产酶菌株的筛选验证

采用3种筛选培养基对同一个红树林沉积物样品进行了筛选,结果表明,3种培养基上获得的菌株数量不同.随后将这27株红树林菌株都采用平板改良法测试了淀粉酶、蛋白酶、脂酶(三丁酸甘油酯)、果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶的活性.统计结果表明,这些菌株中,木聚糖酶阳性1株;纤维素酶阳性3株;果胶酶阳性7株,弱阳性1株;淀粉酶弱阳性1株;蛋白酶阳性6株,弱阳性2株;酯酶(三丁酸甘油酯)阳性2株,弱阳性9株.其中,菌株同时具有两种以上酶活力的有3株.酶活水解圈直径与菌落直径比值范围分别是:果胶酶0.3～3.3,蛋白酶0.4～2.2,脂酶(三丁酸甘油酯)1.5.

3 实验结果与讨论

3.1 红树林可培养菌株多样性

红树林生态系统不仅是鸟类、鱼虾贝类、微生物的聚集地,还蕴含着丰富、独特的微生物资源.红树林来源的微生物可产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、果胶酶、琼脂糖酶等多种用途广泛的酶类.此外,红树林微生物还可代谢产生化学结构丰富的次级代谢产物,如生物碱类、环肽类、大环内酯类、多糖类、不饱和脂肪酸类等.这些代谢产物大多具备生物活性,例如抗菌、杀虫、细胞毒性、抗氧化、抑制剂等[8].因此,从红树林环境筛选新的产木聚糖酶、酸性果胶酶和纤维素酶菌株的概率较大.本研究对红树林沉积物产木聚糖酶、酸性果胶酶和纤维素酶进行富集筛选,经过16S rRNA基因和18S rRNA基因测序、剔除重复后,共获得27株菌.

木聚糖筛选获得6株细菌,分属于Curtobacterium(2株)、Leifsonia(1株)、Mangrovibacter(1株)、Klebsiella(1株),以及Pantoea(1株)等5个属,其中Mangrovibacter、Klebsiella、Pantoea属于γ-变形菌纲,Curtobacterium、Leifsonia属于放线菌纲;5株丝状真菌分属于Trichoderma(2株)、Aureobasidium(1株)、Fusarium(1株)、Aspergillus(1株);2株酵母菌Geotrichum(1株)和Kluyveromyces(1株).木聚糖酶产生菌中,以真菌和细菌为主,真菌占53.8%,这与其他木聚糖酶产生菌的筛选报道结论基本吻合.

酸性果胶筛选获得了3株菌.分别属于γ-变形菌纲、酵母亚门、毛霉亚门的Celerinatantimonas、Candida和Mucor3个属.酸性果胶的相关研究较少,主要产酶菌株是真菌.

纤维素筛选获得了11株细菌,分别属于Oceanimonas(2株)、Vibrio(2株)、Pseudomonas(2株)、Algoriphagus(2株)、Pseudoalteromonas(1株)、Isoptericola(1株)、Gordonia(1株)7个属,其中Oceanimonas、Vibrio、Pseudomonas、Pseudoalteromonasa属于γ-变形菌纲,Algoriphagus属于拟杆菌纲,Isoptericola、Gordonia属于放线菌纲.已报道的纤维素酶产生微生物主要有真菌、放线菌和部分酵母菌[11],关于细菌产纤维素酶方面的研究报道较少.

本研究针对3种不同酶筛培养基获得的菌株进行比较分析,结果显示在不同的培养条件下获得了不同的菌株.所有获得的菌株,真菌占比33.3%,放线菌占比18.5%,细菌占比48.2%.其中,细菌中γ-变形菌纲占比40.7%,拟杆菌纲占比7.4%.这说明有针对性的设置培养方式,能有效减少细菌资源的遗漏.孙超等[12]在红树林沉积物中,利用不同天然有机多聚物富集分离到的优势可培养细菌为变形菌门、拟杆菌门.真菌和放线菌是红树林环境中的常见类群,分离的菌株一般有很好的耐盐耐碱性质,具有潜在的研究和工业应用价值.这与本实验获得菌株类型一致.

3.2 红树林可培养菌株产酶活性鉴定

通过底物特异性筛选表明:木聚糖酶活阳性菌株仅有1株戈登氏菌(Gordonia),且为弱阳性.纤维素酶活阳性3株分别是弧菌(Vibrio)2株和大洋单胞菌(Oceanimonas)1株.果胶酶活阳性7株,分别是弧菌(Vibrio)2株、短小杆菌(Curtobacterium)2株、雷夫松氏细菌(Leifsonia)1株、克鲁维酵母(Kluyveromyces)1株、暂无(Celerinatantimonas)1株、出芽短梗霉(Aureobasidium)1株、红树林小杆菌(Mangrovibacter)1株;蛋白酶活阳性6株,分别是短小杆菌(Curtobacterium)2株、弧菌(Vibrio)1株、假交替单胞菌(Pseudoalteromonasa)1株、噬冷菌(Algoriphagus)1株、出芽短梗霉(Aureobasidium)1株,弱阳性2株为弧菌(Vibrio)1株和克鲁维酵母(Kluyveromyces)1株.酯酶(三丁酸甘油酯)酶活阳性2株弧菌(Vibrio)1株和假交替单胞菌(Pseudoalteromonasa)1株;弱阳性9株,分别是噬冷菌(Algoriphagus)1株、假丝酵母(Candida)1株、短小杆菌(Curtobacterium)2株、白蚁菌(Isoptericola)1株、克鲁维酵母(Kluyveromyces)1株、雷夫松氏细菌(Leifsonia)1株、红树林小杆菌(Mangrovibacter)1株、毛霉(Mucor)1株.淀粉酶活弱阳性1株,为白蚁菌(Isoptericola).实验表明产酶活力最好的菌株:酸性果胶酶菌株为MCCC 1A17838(Vibrio),蛋白酶、酯酶菌株为MCCC 1A17837(Pseudoalteromonasa),纤维素酶菌株为MCCC 1A17838(Vibrio)、MCCC 1A17836(Vibrio)、MCCC 1A17835(Oceanimonas),木聚糖酶菌株为MCCC 1A17909(Gordonia),可为接下来应用提供参考价值.

据报道,Trichoderma[13]菌株具有产木聚糖酶能力,Aspergillus[14]菌株具有产木聚糖酶、酸性果胶酶能力.虽然个别菌株用酶活平板法验证木聚糖酶活性时没有检测到透明圈,但定量分析却检测到其具有酶活性,这可能是因为活性比较弱造成的.在产纤维素酶的细菌和羧甲基纤维素钠的研究中,Avellanedatorres等[15]从哥伦比亚内瓦多斯国家自然公园筛选到了25株细菌,产纤维素酶菌群主要为假单胞菌.高兆明[16]从厦门红树林泥样中分离到1株具有活性纤维素酶基因的新种Vibrio(G21),并对其纤维素酶基因进行了克隆和重组表达.在本实验中Vibrio也同样有纤维素酶活性.

3.3 红树林可培养菌株潜在新种资源

本研究从红树林沉积物中分离鉴定到27株可培养菌株.其中潜在新种资源4株,分别是细菌MCCC 1A17872(Celerinatantimonas)和MCCC 1A17842(Isoptericola),酵母菌MCCC 2A00428(Candida)和丝状真菌MCCC 3A01722(Mucor),获得的新种资源为微生物系统进化提供实际依据,目前已开展对MCCC 1A17872(Celerinatantimonas)的系统分类学鉴定.

4 结论

本研究通过对红树林沉积物进行富集培养、分离、纯化、酶活性测定、鉴定等过程,获得了27株具有产木聚糖酶、酸性果胶酶和纤维素酶能力的菌株。这27株菌中,18株为细菌、3株为酵母、6株为丝状真菌.木聚糖酶、酸性果胶酶和纤维素酶在食品、饲料、工业、能源、纺织等领域具有重要的应用价值.因此,这些产酶菌株的获得不仅丰富了产酶微生物资源,同时为酶类微生态制剂的开发应用提供了可能.