1例RhCE抗原缺失型个体的分子机制研究

李小薇 赵明明 雷慧芬 李翠莹

空军军医大学空军特色医学中心输血科，北京 100142

Rh血型系统是人类血型系统中最复杂且最具多态性的血型系统，其临床意义仅次于ABO血型系统[1-3]。ISBT目前确认的Rh血型系统抗原达56个，其中D、C、c、E和e抗原均具有很强的免疫原性，是临床上产生同种免疫性抗体最常见的5种抗原。迄今为止，ISBT已经确认了超过160种RHCE等位基因，这些等位基因可导致抗原弱表达、部分表达等变异体产生[4]。Rh缺失型D--是非常罕见的，即红细胞上D抗原表达正常，但C/c、E/e抗原表达均缺失，其分子遗传基础多种多样，包括基因插入、缺失、重排等。血型基因检测方法能够克服血型血清学检测局限，结果判断更加客观，逐渐成为准确判断疑难血型必不可少的重要辅助手段[5-7]。本研究对Rh缺失型D--患者及其父亲血型采用血清学及RHCE基因外显子测序研究，首次分析发现由于第8外显子缺失导致RhCE血型抗原不表达，现报告如下。

材料与方法

1 研究对象

2023年3月就诊于本中心儿科患者1名，男性，12岁，诊断为特应性皮炎，既往无输血史，送输血科进行血型和不规则抗体筛查。

2 仪器与试剂

ABO血型反定细胞A1细胞、B细胞（批号：202302006，江苏力博医药生物技术股份有限公司）；红细胞不规则抗体筛查细胞（批号：202302001，江苏力博医药生物技术股份有限公司）；IgM抗-C、抗-c、抗-E和抗-e单克隆抗体试剂（批号：2150031，BIOSCOT）；ABO及RHD血型鉴定凝胶卡（批号：202302006，江苏力博医药生物技术股份有限公司），Rh分型鉴定凝胶卡（批号：202211007，江苏力博医药生物技术股份有限公司）；核酸提取或纯化试剂（批号：21072810T148，西安天隆科技有限公司）；核酸提取仪NP968-C（西安天隆科技有限公司），基因扩增仪LifeECO（杭州博日科技有限公司），通用型电泳仪JY300C（北京君意东方电泳设备有限公司），测序仪ABI 3130xl（美国ABI公司）。

3 方法

3.1 ABO及Rh血型血清学鉴定

采用微柱凝集法鉴定患者及其父亲ABO及RhD血型，采用盐水法和微柱凝集法鉴定患者Rh血型C、c、E和e表型，具体操作方法参照试剂说明书。

3.2 红细胞不规则抗体筛查

采用微柱凝集法筛查患者红细胞不规则抗体情况，具体操作方法参照试剂说明书。

3.3 DNA提取

按照试剂盒说明书提取患者及其父亲血液标本DNA，采用微量紫外核酸分析仪测定DNA浓度和纯度，调整DNA浓度至30 ng/μL，A260/A280为1.6～2.0。

3.4RH基因测序

患者及其父亲样本分别进行RHCE基因第1～10外显子测序，确定基因型特征。采用Sanger测序法，将目的片段扩增后，测序仪进行RHCE基因第1～10外显子测序，并读取结果及分析。根据ISBT网站提供的RH（ISBT 004）Blood Group Alleles：RHCE（004RHCEalleles v4. 0_20180208），以及BLAST序列比对（标准序列BN000065.1以及RHCE*CeMN091966.1），确定是否存在基因突变及其所在基因位置，本研究设计测序引物与扩增引物一致（表1），测序反应送公司完成（天津市秀鹏生物技术开发有限公司）。

表1 RHCE扩增（测序）引物序列

按照以下反应体系对RHCE基因第1～10外显子进行扩增：dNTP-Buffer工作液43.5 μL，Taq酶（5 units/μL）0.5 μL，特异性引物对（300 nM）1.0 μL，DNA 5 μL，总体积50 μL。

反应程序如下：96℃ 2 min，1组循环；96℃20 s，68℃ 60 s，5组循环；96℃ 20 s，64℃ 50 s，72℃ 90 s，10组循环；96℃ 20 s，61℃ 50 sec，72℃ 90 s，25组循环；72℃ 5 min，1组循环。扩增产物使用2.5%琼脂糖凝胶进行分离，确定产物条带均一且亮度足够后，进行测序。使用chromespro软件以及DNAMAN8.0软件进行比对分析。

结 果

1 ABO及Rh血型血清学鉴定

微柱凝集法显示患者及其父亲红细胞ABO血型均为O型，微柱凝集法及盐水法显示患者红细胞与抗-D凝集强度为4+，与抗-C、抗-c、抗-E 和抗-e凝集强度均为0，Rh血型为Rh缺失型D--；父亲红细胞与抗-D、抗-c、抗-E凝集强度为4+，与抗-C、抗-e凝集强度为0，Rh血型为RhccDEE（表2）。

表2 患者及其父亲ABO及Rh血型血清学结果

红细胞不规则抗体显示患者血浆与红细胞不规则抗体筛查3细胞凝集强度均为0，自身对照及直接抗人球蛋白试验均为阴性。

2 RHCE基因测序扩增凝胶图分析

RHCE*c和RHCE*C通常在第2外显子上通过特异点进行区分（表3），但因为RHD和RHCE*C的第2外显子上基因无区别点，故本例患者（RHD基因阳性）RHD基因第2外显子干扰RHCE*C的检出，本研究通过第12孔（RHCE*C在非外显子区域内含子2中表达剪切点位置区分于RHCE*c和RHD的特异性点[8]）检测RHCE*C基因的存在。患者及其父亲均检测到RHCE*C（第12孔阳性）（图1），证明均存在RHCE*C等位基因。扩增图第2孔（CE-Exon2）检测的是RHCE*c等位基因的第2外显子，患者第2外显子为阴性，故RHCE*c等位基因缺失；患者的父亲第2外显子为阳性，故RHCE*c等位基因存在。

图1 患者及其父亲RHCE基因第1～10外显子测序扩增凝胶图

表3 RHCE（ISBT 004）血型等位基因分布

3 RHCE基因测序分析

患者及其父亲第2外显子测序结果提示第2外显子突变点是RHCE*C的突变点，进一步证明患者及其父亲均存在RHCE*C等位基因（表3）。患者第2外显子的突变均为纯合，第1外显子上存在48G＞C杂合突变，提示存在RHCE*c等位基因，在第5外显子上未发现RHCE*E突变点（676G），并且第8外显子为纯合缺失，提示存在RHCE*Ccee等位基因但序列不完整，导致其抗原表达为RhD--，第3-7，9-10外显子均未检测到突变（图2）。患者的父亲第2外显子的突变均为杂合，第1外显子上存在48G＞C杂合突变，提示存在RHCE*c等位基因，在第5外显子上发现RHCE*E突变点（676G＞C），提示其存在RHCE*CcEe等位基因；第3，4，6，7，8，9，10外显子未检测到突变，且根据患者第8外显子为纯合缺失，推测患者的父亲为第8外显子杂合缺失，缺失的单倍体为RHCE*Ce，导致其未能正确表达RhCe抗原，故患者的父亲血清学表现为RhccDEE（图3，表2）。因此，可以判断患者RHCE基因型为RHCE*Ccee，但由于第8外显子发生纯合缺失，导致RhCe抗原不表达。患者的父亲RHCE基因型为RHCE*CcEe，存在第8外显子杂合缺失，且该变异的RHCE*Ce等位基因遗传给了患者。

图2 患者RHCE基因第1，2外显子测序结果

图3 患者的父亲RHCE基因第1，2，5外显子测序结果

讨 论

Rh血型系统属于复杂多变的血型系统，Rh抗原部分或者完全缺失是十分罕见的表型。日本研究人员在6万多名献血者中，研究发现Rh缺失型D--仅7例，频率约为0.01%[9]。国内针对Rh缺失型D--分布频率的相关研究多为D--个案报道，尚未见Rh缺失型D--人群分布研究。目前血型的判断仍然主要依据血清学结果，但在血型检测过程中往往出现一些疑难样本，结合血型基因检测方法进行基因结构分析和解读，不仅可以准确鉴定患者血型，而且对于安全输血具有重要的参考价值。

RH血型基因是由RHD与RHCE2个基因串联排列组成的。RHD基因编码D抗原，RHCE基因编码C/c和E/e抗原，2个基因均由10个外显子和9个内含子组成，编码417个氨基酸[10]。在Rh血型系统中，编码RhC和Rhc抗原的RHCE等位基因有6个核苷酸不同，而编码RhE和Rhe抗原的RHCE等位基因仅有1个核苷酸的差异，RHD和RHCE基因具有93.8%同源性，且紧密连锁，因此2个基因之间易发生基因置换、基因杂交、基因重排等现象，引起RH基因变异[11-12]。Rh抗原缺失的血清学表现虽然为对应的D、C、c、E、e抗原的缺失，但是其产生的分子机制却不尽相同；即使是表型相同的Rh缺失型D--，其发生的分子机制也不一样。张秀铮等[13]发现1例Rh缺失型D--的RHCE基因第1、10 外显子检出RHCE基因的特异性序列，而第2、3、6、7、8、9外显子则全为RHD基因序列；伍伟健等[14]分析1例Rh缺失型D--，未检出RHCE基因的特异性序列；左琴琴等[15]分析2例Rh缺失型D--，基因型分别为RHCE-D（3-7）-CE、RHCE-D（3-8）-CE，其发生与RHCE基因和RHD基因之间的基因重组相关；Flatt等[16]分析2例Rh缺失型D--，基因型分别为RHCE-D（2-8）-CE、RHCE-D（4-9）-CE；Pham等[10]研究发现RHCE基因剪接位点突变导致剪接模式的改变和缺失会引起mRNA转录本异常，影响RhC/c、E/e抗原表达。本文对Rh缺失型D--表型患者的分子遗传背景研究发现，存在RHCE基因第8外显子纯合缺失导致RhCE血型抗原不表达。

Rh缺失型D--表型个体比较罕见，但因其RhC/c、E/e抗原均不表达，导致D--个体受到输血或妊娠等免疫刺激后，很容易产生针对C/c、E/e位点的特异性抗体，即抗-Hro联合抗体。抗-Hro抗体为针对Rh血型系统的高频抗原联合抗体，采用吸收放散试验很难将其分离并进行抗体特异性鉴定，其与普通Rh血型红细胞均可发生凝集反应，仅与Rhnull、Rhmod及RhD--红细胞不发生凝集反应[17-18]。因此，Rh缺失型D--个体受到免疫刺激产生抗-Hro抗体后，很难找到相合的血液与之匹配。此外，Rh缺失型D--育龄期女性一旦产生抗-Hro抗体，常常会导致习惯性流产、死胎及胎儿新生儿溶血病等严重后果[19-21]。Rh缺失型D--个体血液极其稀有，临床输血时可选择自体输血或在家系成员中筛选配合型血液；孕妇存在胎儿新生儿溶血病时，可采用血浆置换，也可对新生儿进行提早分娩、静脉注射免疫球蛋白、蓝光照射等综合治疗方式，以取得满意的疗效。本文Rh缺失型D--表型患者为男性，既往无输血史，红细胞不规则抗体筛查阴性，已告知家属患者为稀有血型，临床输血时选择自体输血或筛选亲属间配合型血液。

综上所述，临床患者的血型检测联合应用血清学和分子生物学技术，对于亚型、稀有血型、弱抗原或抗体等疑难血型的准确鉴定具有重要意义。本研究首次发现第8外显子缺失造成RhCE血型抗原不表达，丰富了Rh抗原缺失变异造成血清学改变的情况，为解决患者安全输血提供参考。本研究未能获取患者母亲的样本，故患者另一条缺失第8外显子的单倍体中其他外显子的基因序列情况尚不清楚，后续研究希望通过单链测序等手段进行单倍体确认，以明确外显子缺失和碱基突变对血型的影响。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。