大鼠肾皮质淋巴管内皮微通道

马巧英 潘伟人 曾凡强 栗峣 马传响 刘志安

肾淋巴管是肾脏脉管系统的一部分，在生理和病理过程中，其在收集细胞间质液并将其返回循环系统方面发挥着重要作用[1]。虽然近几十年来文献已报道了在人体和各种动物的生理和病理条件下肾脏的血管系统、淋巴分布和形态学特征[1-7]，但一些问题尚未解决。例如，淋巴是如何从肾间质进入淋巴-循环系统的，淋巴的微通道在形态学上是什么样子的？一些研究表明，淋巴通路可以以某种方式在其内皮细胞之间找到[8-13]，但是，事实上肾脏的“真正”淋巴内皮微通路尚未在形态学上得到权威证实，这不仅阻碍了生物技术研究的进展，还影响了精准医学的发展，尤其是肾脏生物工程和三维（3D）组织打印[14]。

近年来，免疫荧光（IF）染色和组织清除的组合方法已被应用于检测3D 组织结构中的神经血管结构[15-17]，此法的应用得以使这些结构在动物模型的生理和病理状况下全面展现。因此，如果使用相同的方法来检测肾脏厚组织切片中的淋巴结构，可能会获得相同的结果。最近，有报道显示在小鼠肾脏皮质厚组织切片中显示了淋巴管的形态结构，并在其管壁上发现了“隧道”样开口[18]。

本研究旨在通过组织学切片、HE 染色、免疫组化（IHC）染色以及扫描电子显微镜（SEM）等技术，探寻大鼠肾皮质中淋巴管的分布并揭示其内皮微通道的形态结构。

1 材料与方法

本实验由徐州医科大学动物伦理委员会批准（L20210226466，中国江苏），并根据徐州医科大学实验动物管理和使用指南进行。

1.1 主要实验试剂及仪器

水合氯醛（CAS#302-17-0，BBI 生命科学有限公司）；LYVE-1 抗体（NB600-1008，Novus Biologicals，美国）；二抗（Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody VC002，Novus Biologicals，美国）；组织切片机（Leica RM2125 RTS，Leica Microsystems P/L，德国）；扫描电镜（HT7700，Hitachi High-Technologies Co.Ltd，日本）。

1.2 实验动物及取材前准备

成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠6 只，体质量250～350 g，由徐州医科大学实验动物中心提供。取肾前，每只大鼠接受10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉。

1.3 取材

从4 只大鼠中获取8 个肾脏，每个肾脏按其水平面切取2 mm 厚的组织块，作为HE 染色和免疫组化检测的组织切片标本，置入4%多聚甲醛（PFA）溶液中固定保存。肾组织获取后，供体大鼠断颈处死。

另2 只大鼠获得4 个肾脏，并即刻从每个肾脏水平切面切取1 mm×2 mm×2 mm 厚组织，作为扫描电镜检测的标本，快速置入2% 戊二醛与4%多聚甲醛混合液中固定，放入冰箱保存。肾组织获取后，供体大鼠断颈处死。

1.4 组织石蜡包埋

肾组织经4%多聚甲醛溶液固定2 d 后，取出，PBS 清洗3 次，置入不同浓度的乙醇梯度脱水：50%乙醇2 h、75%乙醇2 h、80%乙醇2 h、90%乙醇1 h、95%乙醇30 min、无水乙醇30 min 2 次、无水乙醇+二甲苯1 : 1 20 min，二甲苯透明30 min，浸蜡2 h 后进行石蜡组织包埋。

1.5 HE 染色观察

石蜡冷却后切7 μm 薄片，48 ℃温水中展片，载玻片捞片，50 ℃烤片30 min，再经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水（无水乙醇、90%、80%和70%乙醇各5 min，蒸馏水洗），苏木精溶液中浸染10 min，清洗2 min，移入1%盐水乙醇20 s，流水清洗30 min，0.6%氨水返蓝，流水冲洗5 min，移入伊红液浸染3 min，水洗，梯度脱水（95%乙醇5 min 2 次，无水乙醇5 min 2 次），二甲苯（5 min 2 次）透明后，中性树胶封片，观察和拍照。

1.6 免疫组织化学显色观察

石蜡切片后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水（同1.4）、3%H2O2孵育、柠檬酸盐溶液高温修复抗原，加LYVE-1 抗体，1 : 800 浓度4 ℃过夜，次日复温加二抗，1 : 2 000 浓度室温下孵育50 min，切片温箱烘干，经二甲苯透明、封片、观察后拍照。

1.7 扫描电镜（SEM）检测

固定标本送扫描电镜检测，PB 漂洗（3～4 h）、置入1% 锇酸溶液再固定、漂洗、梯度脱水、临界点干燥、组织块粘托、镀膜后寻找和观察目标结构，并拍照留存。

2 结果

2.1 HE 染色与免疫组织化学显色

大鼠肾脏的HE 染色切片上除了可见肾小球、肾小管和动静脉外，难以发现淋巴管管壁，但通过LYVE-1 的IHC 染色可见其散在地分布（图1），外形不规则，管壁菲薄，在二维图像中以不同的形状及大小（管径在10～30 μm）存在，有些细胞核突入管腔中。

图1 大鼠肾皮质内淋巴管（标尺=20 μm）Fig.1 Lymphatic vessels in the kidney of the rat (Scale=20 μm)

2.2 扫描电子显微镜检测

大鼠肾皮质中淋巴管外表可见散在分布的内皮微通道入口，包含半圆形的“穹隆顶部”和平坦的“底部”（图2）。高度约为8 μm，宽约14 μm。代谢产物散布在其周围，其中一些聚集在入口处。

图2 大鼠肾皮质淋巴管壁上内皮微通道的SEM 观察Fig.2 SEM observation of the endothelial microchannel in the wall of the lymphatic vessel of the renal cortex in the rat

3 讨论

肾淋巴管在收集细胞间液和大分子代谢产物等返回循环系统、肿瘤转移和免疫活动中发挥着非常重要的作用[1]。对于肾淋巴管解剖的认识始于早期的水银灌注研究[19]，以及随后的间接注射染料混合物的研究[2-5，8-10，20-21]，其仅显示了肾脏周围淋巴管的分布和引流，但肾内淋巴管的分布及详细超微结构尚未完全被显示。最近的报道显示，利用IF 染色、组织清除和扫描电子显微镜（SEM）技术，在小鼠厚肾组织切片中揭示了肾内淋巴管（特别是内皮微通道）的三维分布和细节[18]。在本研究中，我们通过组织切片、HE 染色、IHC 染色和扫描电子显微镜（SEM）技术，揭示了大鼠肾内淋巴管（尤其是内皮微通道）的细节。

此外，将本实验结果与本研究团队已报道的小鼠实验结果相比较[18]，我们注意到大鼠与小鼠的肾皮质组织结构相似，由于肾皮质内的淋巴管排列无序，腔内淋巴液充盈程度的不同，因此组织切面上可见大小不一、形状各异的淋巴管的形态学表现（图1）。从SEM 的结果对照来看，大、小鼠的肾皮质淋巴管壁上内皮微通道入口的微观形态特征相同（图3），都包含一个半圆形的“穹隆顶部”和平坦的“底部”（图2、3）。代谢产物散布在其周围，其中一些聚集在入口处。不同之处在于它们的宽度和高度。由于本研究作为一个前期报道，扫描电镜的标本仅为4 例，数量不够用作统计学处理，所以直接测量此入口的宽度和高度并引入本文。本研究组将努力收集数据，待数据（此入口在开放和/或闭合情况下）积累到一定数量再作详细的统计学处理和报道。

既往研究表明，毛细淋巴管的细胞间隙被认为是细胞间质液和大分子代谢产物等进入淋巴管的主要通道[1-2，7，10-13，22]，我们在发现小鼠肾皮质淋巴管壁存在淋巴内皮微通道后（图3B），同样在大鼠的肾皮质淋巴管壁发现相似结构（图2），即：其入口由半圆形的“穹隆屋顶”和平坦的“底部”形成（图3）。我们假设这种特殊的结构可以被视为内皮微通道的“门”，用于控制间质液和代谢产物的进入。当淋巴管充满淋巴时，管腔内压力增加，“底部”升高，“门”被关闭（图4A）。相反，在淋巴被排空到较大的淋巴管后，管腔内压力降低，“底部”下降，“门”被打开，间质液和代谢物进入淋巴管腔（图4B）。这一过程可能是淋巴管清除肾组织间液和代谢产物的机制。

最后，有必要提出一些问题和猜测，以期通过进一步研究得以证实：①内皮微通道是否可以在其他器官或组织的淋巴管中发现？②人体中是否存在类似的结构？③病理条件是否会导致结构变化？

4 结论

本文介绍了大鼠肾皮质淋巴管内皮微通道的形态结构，可为进一步的基础科学研究、组织工程、3D 组织打印以及临床应用提供实验动物的形态学理论基础。