慢性活动性EBV感染患者外周血淋巴细胞表达水平及预后危险因素分析*

张叶萌 张莹 张延霞

(东营市人民医院1.输血科;2.检验科,山东 东营 257000)

EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)是人类已知的疱疹病毒之一,其世界范围内感染率超过90%[1]。研究表明,EBV的原发感染多为急性感染,患者可无典型临床症状或进展为传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis,IM)[2-3]。部分无明显免疫缺陷的患者,在感染EBV后,可表现为病毒持续活动性的复制,而不进入潜伏感染状态,或者在进入潜伏感染状态后病毒再次大量复制,促使患者IM症状反复出现,并导致间质性肺炎、噬血细胞综合征、弥漫性血管内凝血等并发症的发生,同时伴有EBV抗体异常改变及病毒载量显著上升,临床将这一阶段称为慢性活动性EBV(Chronic active Epstein-Barr virus infection,CAEBV)感染[4]。CAEBV的发病机制目前尚待明确,研究认为可能与患者免疫功能异常密切相关[5]。既往关于CAEBV的诊疗无统一金标准,临床上主要采用血清学特异性抗体检测、血清EBV-DNA定量检测等方式,但均存在一定不足,因此探讨其生物学指标表达水平及影响预后的危险因素具有十分重要的临床意义[6-9]。研究发现,EBV可通过感染T淋巴细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞等导致机体的免疫机制出现紊乱,故本研究认为外周血淋巴细胞表达水平在一定程度上可反映CAEBV患者的病情[10-11]。基于此,本研究通过探讨CAEBV感染患者外周血淋巴细胞表达水平及影响预后的危险因素,旨在为临床诊治CAEBV提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月—2021年1月我院收治的64例CAEBV患者为CAEBV组,同期64例IM患者为IM组,64例体检健康人群为对照组。本研究通过医院伦理委员会批准(审批号:2016023)。

1.2 诊断标准及纳入、排除标准 IM诊断标准为[12]:①出现急性发热、咽峡炎、肝脾大、淋巴结肿大等临床症状。②血象结果显示淋巴细胞比例上升(>50%),异型淋巴细胞比例上升(>10%)。③EBV衣壳抗原抗体阳性或外周血EBV DNA检测阳性。④排除HIV、CMV等病毒感染。CAEBV患者符合2005年Okano等制定的相关标准[12]:①患者表现为持续性或者复发性IM症状。②早期抗原以及EBV衣壳抗原抗体上升或外周血EBV DNA水平上升。③慢性病程无法用其他已知疾病解释。纳入标准:①IM组符合IM诊断标准,CAEBV组符合CAEBV诊断标准,对照组为近1个月内体检健康者。②研究对象及其家属知情且签署知情同意书。③未合并其他严重疾病者。排除标准:①合并心肌炎、血小板减少症、肝炎等疾病者。②近3个月内服用糖皮质激素或使用免疫抑制剂者。③合并感染性、免疫系统等其他严重疾病者。④依从性差者。

1.3 方法 ①所有研究对象均于入组时(IM组及CAEBV组为未接受治疗前)抽取静脉血5 mL×3管,采用乙二胺四乙酸抗凝。②一管采用全自动血细胞分析仪( XN 2000,日本希森美康)检测白细胞计数、淋巴细胞计数。③一管采用流式细胞仪(EPICS-XL型,美国Beckman公司)检测CD3+(抗体克隆号:RM-11)、CD4+(抗体克隆号:RM-11)、CD8+(抗体克隆号:RM-17)、CD4+/CD8+(抗体克隆号:RM-22)、CD4+CD28+(抗体克隆号:RM-31)、CD8+CD28+(抗体克隆号:RM-19)、CD4+CD25+(抗体克隆号:RM-47)、DR+CD8+(抗体克隆号:RM-42)、CD38+CD8+(抗体克隆号:RM-47)、初始CD4+CD62L+CD45RA+(抗体克隆号:RM-18)、初始CD8+CD62L+CD45RA+(抗体克隆号:RM-26)、效应记忆CD4+CD62L-CD45RO+(抗体克隆号:RM-23)、效应记忆CD8+CD62L-CD45RO+(抗体克隆号:RM-54)、NK细胞、B细胞水平。各检测管中加入10 μL待检测指标FITC标记的单克隆抗体,并加入100 μL全血,振荡混匀后,室温孵育,洗涤,调节并校正流式细胞仪光路和液路,确定变异系数值<2%,设立荧光染色阴阳分界线,每管读取5000个细胞进行标本检测,根据各类细胞FoxP3表达情况设置门逻辑,计算各类细胞相对表达比例。每组实验重复3次。所有淋巴细胞单克隆抗体均购于美国eBioscience公司。④一管采用荧光定量PCR法检测DNA水平,采用DNA提取试剂盒提取外周血淋巴细胞EBV DNA,通过EBV检测试剂盒进行荧光定量PCR反应(TC100 PCR仪,Bio-Rad公司,美国),检测下限为500拷贝/mL,反应体系为:95 ℃ 预变性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循环35次。每组实验重复3次。试剂盒均购于德国Simga公司,所有试验严格按照质量管理标准操作规程进行。⑤对CAEBV组患者随访1年,记录患者存活状态。并根据是否存活分为存活组(n=49)和死亡组(n=15)。

1.4 观察指标

1.4.1 主要指标:①比较3组CD3+、CD4+、CD8+水平。②比较3组T细胞功能亚群、调节亚群及激活亚群水平(CD4+CD28+、CD8+CD28+、CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+)。③比较3组CD4+和CD8+初始T细胞、记忆T细胞亚群水平。

1.4.2 次要指标:①比较3组白细胞计数、淋巴细胞计数水平、外周血NK细胞、B细胞水平。②对CAEBV患者进行随访,根据患者结局分为存活组和死亡组,收集两组一般资料,包括年龄、性别、白细胞计数、淋巴细胞计数、血小板计数、总胆红素、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白、血清铁蛋白及T淋巴细胞亚群水平。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 3组在年龄、性别构成、BMI等资料上比较,差异无统计学意义(均P>0.05),见表1。

表1 3组一般资料比较

2.2 3组白细胞计数及淋巴细胞计数水平比较 结果显示,相较于对照组,IM组白细胞计数、淋巴细胞计数水平更高,而CAEBV组白细胞计数、淋巴细胞计数水平更低。IM组及CAEBV组白细胞计数、淋巴细胞计数水平比较均具有统计学差异(P<0.05),见图1。

图1 3组白细胞计数及淋巴细胞计数水平比较

2.3 3组B细胞、NK细胞及CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平比较 相较于对照组,IM组CD3+、CD4+、CD8+水平更高,而NK细胞、B细胞水平更低(P<0.05);CAEBV组CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞、B细胞水平均更低(P<0.05)。IM组及CAEBV组CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞、B细胞水平比较水平均具有统计学差异(P<0.05),见表2。

表2 3组B细胞、NK细胞及CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平比较

2.4 3组T细胞功能亚群、调节亚群及激活亚群水平比较 相较于对照组,IM组CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平更高,而CD4+CD28+、CD8+CD28+水平更低(P<0.05);相较于对照组,CAEBV组CD4+CD28+、CD8+CD28+水平更低,而CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平更高(P<0.05)。IM组及CAEBV组CD4+CD28+、CD8+CD28+、CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平比较均具有统计学差异(P<0.05),见表3、图2。

图2 流式细胞图

表3 3组T细胞功能亚群、调节亚群及激活亚群水平比较

2.5 3组CD4+和CD8+初始T细胞、记忆T细胞亚群水平比较 相较于对照组,IM组效应记忆CD4+CD62L-CD45RO+、效应记忆CD8+CD62L-CD45RO+更高,而初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平更低(P<0.05);相较于对照组,CAEBV组初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平更低,而效应记忆CD4+CD62L-CD45RO+、效应记忆CD8+CD62L-CD45RO+更高(P<0.05)。IM组及CAEBV组各CD4+和CD8+初始T细胞、记忆T细胞亚群水平比较均具有统计学差异(P<0.05),见表4。

表4 3组CD4+和CD8+初始T细胞、记忆T细胞亚群水平比较

2.6 存活组及死亡组各指标水平比较 结果显示,截止随访,共15例患者死亡,存活组与死亡组在EBV DNA拷贝数、血小板计数、总胆红素、AST、白蛋白、血清铁蛋白、CD4+CD28+、CD38+CD8+、初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平上比较均有统计学差异(P<0.05),见表5。

表5 存活组及死亡组各指标水平比较

2.7Logistic回归分析结果 对单因素分析具有统计学差异的指标进行赋值:EBV DNA>105拷贝/mL为1,EBV DNA≤105拷贝/mL为0;血小板计数<50×1012/L为1;血小板计数≥50×1012/L为0;AST>75.92 U/L为1,AST≤75.92 U/L为0;白蛋白<30 g/L为1,白蛋白≥30 g/L为0;血清铁蛋白>5 000 μg/L为1,血清铁蛋白≤5 000 μg/L为0;CD4+CD28+<91.94%为1,CD4+CD28+≥91.94%为0;CD38+CD8+>33.94%为1;CD38+CD8+≤33.94%为0;初始CD4+CD62L+CD45RA+<29.87%为1;初始CD4+CD62L+CD45RA+≥29.87%为0;初始CD8+CD62L+CD45RA+<18.94%为1;初始CD8+CD62L+CD45RA+≥18.94%为0。进行Logistic回归分析,条件为:向前,LR。结果显示,EBV DNA>105拷贝/mL、血小板计数<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清铁蛋白>5 000 μg/L是CAEBV患者死亡的独立危险因素(P<0.05),见表6。

表6 Logistic回归分析结果

3 讨论

研究表明,EBV感染人体后,病毒胞膜糖蛋白可与B淋巴细胞膜受体CD21相结合,进而潜伏感染,促进EBV的复制。而T细胞介导的免疫应答反应可对受到感染的B淋巴细胞进行清除[13-15]。因此通过辅助检查T淋巴细胞表达水平对于疾病的诊治具有十分重要的临床意义。

白细胞及淋巴细胞在抵御外界因素刺激中具有重要作用,而NK细胞则是机体天然免疫的主要承担者。T淋巴细胞亚群在机体免疫机制中发挥着重要作用,其中CD3+细胞以及CD4+细胞可促进机体细胞免疫反应,而CD8+T细胞具有抑制机体免疫应答的功能。正常生理条件下,CD4+与CD8+处于动态平衡状态。本研究结果显示,相较于正常人群,IM患者及CAEBV患者白细胞计数、淋巴细胞计数、B细胞、NK细胞水平及T淋巴细胞亚群水平均存在一定差异,提示两种疾病患者的免疫功能均存在紊乱情况。其中IM患者白细胞计数、淋巴细胞计数均有所上升,而B细胞及NK细胞水平则有所下降。研究表明,EBV病毒可使NK细胞失去清除病毒的能力,且在入侵机体后,可促使T细胞大量增殖,并形成强烈的细胞免疫反应,从而识别被感染的B淋巴细胞,并促进其凋亡[16-17]。此外该过程还可抑制B淋巴细胞的增殖、分化过程[18-19]。因此,在EBV感染急性期,患者可表现为T淋巴水平显著上升,而B细胞和NK细胞水平显著下降。而当患者未及时得到有效治疗时,T淋巴细胞和B淋巴细胞之间的作用将会进一步增强,并导致B细胞活动进一步受限,导致B细胞水平进一步下降[20]。本研究结果显示,CAEBV患者白细胞计数、淋巴细胞计数、B细胞及NK细胞计数水平均显著下降,这也说明CAEBV患者的免疫功能紊乱情况更为严重。T淋巴细胞亚群中,相较于正常人群,IM组患者CD3+、CD4+、CD8+水平均显著上升,而CAEBV患者则CD3+、CD4+、CD8+水平均有所减少。这提示IM患者CD3+、CD4+、CD8+在高度活化,从而有利于EBV的清除。而CAEBV患者由于T淋巴细胞处于下降状态,导致难以清除EBV病毒,引起EBV的持续感染。

CD28为T细胞正常激活的第二信号,既往有研究发现,急性早期EBV感染患者存在CD28细胞下调暂时无能状态,这可能与T细胞在参与对病毒的免疫应答过程中,已活化的T细胞暂时无反应状态有关[21]。本研究结果显示,相较于正常人群,IM患者CD4+CD28+、CD8+CD28+水平有所下降,而CAEBV患者CD4+CD28+、CD8+CD28+水平虽有所下降,但高于IM组水平。其可能机制为CAEBV缺乏急性早期感染阶段中的CD28细胞下调无能状态阶段,而这可能也是EBV感染慢性活动性的病程特点。CD25分子参与抑制过度活化的自身免疫反应,CD4+CD25+细胞作为T细胞调节亚群可抑制免疫反应和维持机体的耐受。本研究结果显示,IM患者CD4+CD25+水平有所上升,而CAEBV患者水平介于IM患者和正常人群之间。这可能与CAEBV患者过度自身免疫炎性反应慢性化存在一定联系。DR+CD8+、CD38+CD8+是病毒导致细胞免疫激活的标志物之一[22]。本研究结果显示,相较于正常人群,IM和CAEBV患者DR+CD8+、CD38+CD8+水平均显著上升,而CAEBV患者水平低于IM组,这可能与疾病的急性早期病毒清除机制和进入慢性活动期存在一定联系,但具体机制仍需进一步探讨。初始T细胞在受到抗原刺激后可转化为效应记忆T细胞。本研究结果显示,相较于正常人群,IM组和CAEBV组初始T细胞水平均有所下降,而效应记忆T细胞水平有所上升,这与邢燕等[23]的研究结果较为一致,其可能机制与免疫逃逸机制导致初始T细胞生成障碍有关。而相较于IM组,CAEBV组初始T细胞水平更高,而效应记忆T细胞水平更低,表明这与CAEBV的慢性活动期存在一定联系。

本研究进一步探讨了影响CAEBV预后的可能危险因素。结果显示,EBV DNA>105拷贝/mL、血小板计数<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清铁蛋白>5 000 μg/L是CAEBV患者死亡的独立危险因素。病毒载量过高往往提示患者可能存在持续性感染,导致病情加重。而血小板在凝血功能、血管内皮细胞再生及修复中具有重要意义。当血小板水平显著下降时可能导致内脏器官的自发性出血,严重危及生命[24]。白蛋白水平下降一方面可能会导致内分泌失调,增加感染风险,另一方面白蛋白水平下降往往提示机体全身性消耗严重,提示患者预后较差[25]。而血清铁蛋白与机体炎性反应存在密切联系,其水平越高往往代表患者炎性反应越严重。因此,在临床诊治过程中,需密切关注上述因素,及时采取控制措施。

本研究的创新点包括:①通过分析CAEBV及IM患者淋巴细胞水平差异,从而进一步为临床上诊断CAEBV提供新的思路。②通过随访获得了影响CAEBV死亡的危险因素,为临床上采取针对性治疗措施提供相关依据。但本研究也存在以下不足:①研究纳入样本量较小。②未对各指标进行动态监测,难以获得连续数据进一步探讨其可能机制。因此,仍需后续大样本研究加以证实。

4 结论

CAEBV患者存在淋巴细胞亚群失衡及免疫功能紊乱,EBV DNA>105拷贝/mL、血小板计数<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清铁蛋白>5 000 μg/L是影响患者死亡的危险因素,需及时采取控制措施。