通过式固相萃取柱净化-光化学衍生-高效液相色谱法测定复合调味料中黄曲霉毒素的含量

岳超,徐欣丰,赵超群,袁堃,王展华,刘柱,陈碧莲,梁晶晶*

(1.浙江省食品药品检验研究院,国家市场监督管理局重点实验室(功能食品质量与安全领域), 浙江省市场监督管理局重点实验室(保健品质量安全重点实验室), 杭州 310052;2.浙江中医药大学,杭州 310053)

随着国民生活水平不断提高,现代人们的餐饮方式多元化加快,外卖、火锅、麻辣烫等成为大部分居民的餐饮首选。为满足不同的饮食需求,复合调味料使用广泛。复合调味料成分复杂多样,其原料、配比、加工方式、储存条件等各不相同。复合调味料的原料如花生酱、芝麻酱、黄豆酱、辣椒油等均存在霉菌毒素污染的风险[1-6],为追求经济效益,存在不法商家使用价廉质次或陈货进行调配的可能,使得该类食品存在较高的安全隐患。

黄曲霉毒素现行有效的国家标准为GB 5009.22-2016,标准中共涉及5个方法,其中第一、二、三法均采用免疫亲和柱净化。此净化方法耗时长、操作复杂、价格昂贵,且用于基质复杂样品时过柱困难、准确度低等问题尤为突出。近年来,通过式的净化固相萃取柱,如EMR-Lipid、PRiME-HLB、ProElut Pls-A等广泛用在检测药物残留、污染物残留方面[7-13],此类亲脂、亲水的新型净化集提取、浓缩、净化为一体,可以有效地去除样品中的脂肪、蛋白质、磷脂等杂质,且无需活化、平衡,实验操作步骤少,检验效率和结果准确度高,但在真菌毒素测定中的应用主要集中在粮食制品和食用油上[14-16],在高油脂、高盐、高蛋白的复合调味料中的应用较少见。

基于复合调味料组成复杂、基质干扰大的特点,本研究建立并优化通过式固相萃取柱净化方法,对花生酱、芝麻酱、黄豆酱、豆豉酱、豆腐乳5种复合调味料共计42批样品中的黄曲霉毒素进行测定,了解复合调味料中黄曲霉毒素的污染风险情况,以期为完善复合调味料中黄曲霉污染风险控制提供对策,为完善法规标准提供数据参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

XR-20AD型高效液相色谱仪(配RF-20A荧光检测器) 日本岛津公司;Milli-Q去离子水发生器 美国Millipore公司;万分之一分析天平 梅特勒-托利多公司;KH5200DE型超声波清洗器 昆山禾创公司;J-34-4型高速研磨匀浆机 深圳市新锐科技发展有限公司;涡旋振荡仪 IKA公司;高速离心机 赛默飞世尔科技公司。

黄曲霉毒素(AF,下同)B1、B2、G1、G2混合对照品溶液浓度分别为1.08,0.33,1.01,0.30 μg/mL(批号:610001-202107,中国食品药品检定研究院);乙腈、甲醇均为色谱纯;实验用水为超纯水。实验中黄豆酱8批、豆豉酱6批、豆腐乳8批均为市购,花生酱10批和芝麻酱10批为餐饮店中的自制调味料。

1.2 实验部分

1.2.1 色谱条件

流动相为乙腈-甲醇-水(20∶20∶60,下同);色谱柱为Zorbax C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱温为35 ℃,流速为1.0 mL/min,进样量为20 μL,荧光检测器激发波长λex=360 nm,发射波长λem=440 nm。此条件下AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2色谱峰分离度良好,色谱图见图1。

1.2.2 标准品的配制

精密吸取黄曲霉毒素对照品混合溶液 0.5 mL置于5.0 mL容量瓶中,用甲醇稀释定容得到混合对照品工作溶液,于-18 ℃保存备用。

1.2.3 样品溶液的制备

称取充分粉碎混匀的试样5.0 g,置于50 mL 离心管中,加入4颗钢珠,准确加入40 mL 80%乙腈-水溶液,高速研磨振摇提取10 min,超声提取10 min,以10 000 r/min离心5 min,上清液待净化。待净化液直接上柱,收集滤液于10 mL离心管中,准确吸取4.0 mL流出液在45 ℃条件下氮气吹干,加入1 mL初始比例流动相复溶,涡旋溶解30 s,通过0.22 μm有机滤膜,待测。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

本研究参考国标方法、《中国药典》方法及现有文献报道方法[3,5,13-14,17]。常用的黄曲霉毒素提取溶液为不同体积比的甲醇-水溶液和乙腈水溶液。结合研究样品基质特点及目标物结构特点,实验考察了70%甲醇-水溶液、70%甲醇-0.1%甲酸水溶液、80%乙腈-水溶液、80%乙腈-0.1%甲酸-水溶液、84%乙腈-水溶液、84%乙腈-0.1%甲酸-水溶液为提取液时黄曲霉毒素的回收率结果,见图2。

图2 不同提取溶剂对4种黄曲霉毒素回收率的影响Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recovery rates of AFB1, AFB2, AFG1, AFG2

由图2可知,乙腈-水溶液为提取溶剂时,黄曲霉毒素的回收率为77.6%～87.6%,明显高于甲醇-水溶液。甲醇易提取出样品中的酸类、醇类、酚类物质,甲醇-水溶液提取离心后,提取液仍浑浊,直接影响后续样品的过柱速度。乙腈为提取液时对脂肪、蛋白、色素等杂质提取较少,适用于后续步骤中固相萃取柱填料的净化需求。黄曲霉毒素对酸度不敏感,提取效率不受甲酸含量的影响。因此,实验最终选择80%乙腈-水溶液为提取溶剂。

2.1.2 净化方式的选择

实验以阴性花生酱的加标样品为研究对象,选取EMR-Lipid、PRiME-HLB、ProElut Pls-A、MycoSep 226 4种通过式固相萃取柱净化,考察3种加标浓度水平下各黄曲霉毒素的回收率,并与免疫亲和柱净化测得的回收率结果进行比较,结果见图3。

图3 不同基质样品黄曲霉毒素的回收率结果Fig.3 The recovery rates of aflatoxins in different substrates

复合调味料样品基质组成复杂,油脂、蛋白质、色素、糖类、食盐等物质含量高,提取液中溶解的油脂、色素等杂质较难去除,导致其加标回收率结果低于其他食品类别。经过PRiME-HLB柱和EMR-Lipid柱净化后,4种黄曲霉毒素的回收率与免疫亲和柱差异小,且AFB1和AFB2的回收率更优;ProElut Pls-A的回收率为57.8%～61.3%,且图谱中干扰大,基线不平,对AFG2的结果准确性影响大;MycoSep 226柱净化对AFG2的回收率影响大,回收率为52.7%～55.6%。

免疫亲和柱净化时特异性强,但本基质样品提取液无法顺利通过免疫亲和柱进行吸附,且洗脱液复溶后仍会出现白色沉淀。EMR-Lipid和PRiME-HLB净化柱均有很好的净化效果,EMR-Lipid为增强型脂质净化材料,基于体积排阻和疏水相互作用的结合来去除脂质,但PRiME-HLB对含有盐、蛋白、磷脂等物质的净化效果更好。依据复合调味料的组成和黄曲霉毒素的结构特点,最终选择PRiME-HLB为净化柱。

2.1.3 提取方式和提取时间的选择

研究过程中发现,豆豉酱在振摇提取过程中容易结团,提取液与样品的接触面积小,使得提取效率低。花生酱和芝麻酱的振摇提取效果好,但30 min才可以提取完全,使得提取液乳化严重。本研究选择高速研磨均质仪,使用钢柱碰撞进而防止样品结团,实现匀浆和振摇提取同时进行。超声提取可以促使植物组织破壁、变形,提取效率高。实验考察了10～30 min的提取效果,最终选择高速研磨均质10 min后超声提取10 min。

2.1.4 复溶溶解的选择

实验比较了甲醇、黄曲霉提取液、初始比例流动相溶液为稀释溶剂时的结果差异。3种溶剂对回收率的影响小,但初始比例流动相复溶时,其溶剂效应小、基线平稳,在测定低浓度AFG2时准确度较其他两种溶剂高。实验最终选择初始比例流动相溶液为复溶溶剂,并高速涡旋1 min充分溶解。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围与定量限

用初始比例流动相溶液稀释混合对照品工作溶液,配制得到7个水平浓度的标准曲线溶液。按照1.2.1项色谱条件进行测定,以峰面积为纵坐标(y)、对照品浓度为横坐标(x),绘制标准曲线,计算回归方程及相关系数(R2)。结果表明,4个目标物在相应质量浓度范围内线性关系良好。以信噪比S/N=10确定方法的定量限(LOQ),结果见表1。

2.2.2 精密度和重复性实验

取第二浓度点混合对照品溶液,连续测定6次,记录4个目标物的峰面积并计算RSD。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的精密度RSD(n=6)分别为0.06%、0.18%、1.06%、0.87%。结果表明仪器的精密度良好。

平行制备阳性样品6份,测定并计算4个目标物含量。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2含量的RSD(n=6)分别为0.67%、2.27%、1.04%、2.67%。结果表明该方法的重复性良好。

2.2.3 不同样品的回收率及精密度

取豆腐乳、花生酱、芝麻酱、黄豆酱、豆豉酱的阴性样品,依照国标中定量限要求(AFB1和AFG1为0.1 μg/kg,AFB2和AFG2为0.03 μg/kg)分别加1×LOQ、5×LOQ、10×LOQ 3个水平浓度的混合对照品溶液进行回收率实验。回收率及RSD结果见表2。 结果显示AFB1和AFG1的回收率均高于AFB2和AFG2,豆腐乳的回收率低于其他样品。

表2 4种黄曲霉毒素在不同调味酱中的加标回收率及相对标准偏差Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of four kinds of aflatoxins in different seasoning sauces

表3 样品中黄曲霉毒素检出情况Table 3 Detection conditions of aflatoxins in samples

2.3 样品的测定

采用PRiME-HLB固相萃取柱,按照1.2.3项方法制备44批样品的供试品溶液,测定样品中黄曲霉毒素的含量。结果显示,黄豆酱中检出2批次,豆腐乳中检出1批次,豆豉酱中未检出。餐饮店自制花生酱和芝麻酱中黄曲霉毒素的检出率高,含量范围AFB1为0.309～4.17 mg/kg,AFB2为0.129～1.01 mg/kg,AFG1为0.219～2.62 mg/kg,AFG2为0.243～1.75 mg/kg,样品中AFB1均符合GB 2761-2017中限量要求。但1批花生酱黄曲霉毒素含量较高,AFB1为28.9 mg/kg,AFB2为1.01 mg/kg,AFG1为15.4 mg/kg,AFG2为1.69 mg/kg,且AFB1不符合GB 2761-2017中限量要求。

3 结论

本研究建立PRiME-HLB固相萃取柱直接通过的净化方式测定复合调味料中黄曲霉毒素的方法。相较于国标中第一、二、三法,本方法更快速、便捷、环保、准确。有效地去除了样品基质中油脂、糖、盐、蛋白质等杂质的干扰,进而提高了样品结果的准确性。PRiME-HLB柱净化过程中无需活化和平衡,上柱溶液无需稀释,检验操作步骤少,检测效率高,重复性好,更适用于大批量样品的检测。

本研究结果显示,预包装复合调味料样品中黄曲霉毒素污染率低,餐饮店中自制样品的黄曲霉毒素污染率高。黄曲霉毒素B族的污染率高于G族,且黄曲霉毒素B1的污染风险最大。餐饮店中自制调味料的原料配比、制作手法各不相同,原料中可能存在同时产生黄曲霉毒素B族和G族的菌株,增加黄曲霉毒素的污染风险,应加强对餐饮店自制调味料中黄曲霉毒素的监管力度。此外,GB 2761-2017标准中仅对AFB1的限量值进行了规定,并无对黄曲霉毒素总量的限量要求。依据“四个最严”的要求,为完善对复合调味料中黄曲霉毒素污染风险的监控,避免此类食品安全问题的发生,建议增加对坚果及籽类、调味品中黄曲霉毒素总量的限量要求。