血清肺腺癌转录相关转录本1、微RNA-1水平与心肌梗死继发室性心律失常的关系研究

司新成，苗鹏飞，辛艳峰，吴振华，卫刚刚

作者单位：临汾市中心医院心血管内科，山西 临汾041000

心血管疾病给世界各地的医保体系和病人带来巨大的负担，不仅治疗费用高昂，且发病率也在逐年上升，其中，包括心肌梗死在内的缺血性心脏病（IHD）是全球心血管疾病相关死亡的主要原因，每年导致近900万人死亡［1］。急性心肌梗死（AMI）是最严重的IHD表现，需要紧急干预，目前通过经皮冠状动脉介入治疗（PCI）或临时起搏器等进行早期干预，已使AMI的存活率得到显著提高［2］。但AMI的病死率仍处于较高水平，且合并室性心律失常（VA）可导致病死率明显升高，即使早期发现和干预，AMI继发VA病人的病死率仍居高不下［3］。越来越多的研究表明，非编码RNA如长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）及微RNA（miRNA）等在心血管疾病中发挥重要作用，可成为疾病的早期诊断标志物。LncRNA肺腺癌转录相关转录本1（MALAT1）可在心血管疾病中发挥调控作用，其异常表达影响内皮细胞及血管的生长，研究显示，缺血-再灌注损伤大鼠血清MALAT1水平明显高于假手术组，或可通过抑制MALAT1水平减轻大鼠心肌缺血-再灌注损伤程度［4］。微RNA-1（miR-1）是心肌组织中的特异性miRNA，研究表明，其在急性冠脉综合征PCI术后心律失常病人血清中水平升高，且与Lown分级有关，能够诊断急性冠脉综合征PCI术后心律失常［5］。本研究探讨AMI病人血清MALAT1、miR-1水平与继发VA的相关性，以期为临床早期预测AMI病人PCI术后继发VA提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 样本量计算：根据公式n=计算，式中Z1-α/2=1.96，δ（容许误差）为0.07，P为预计AMI病人心律失常发生率，取40%。至少需要188例AMI病人作为研究对象进行研究。选取2019年10月至2021年6月临汾市中心医院收治的AMI病人270例为研究对象，病人均行PCI治疗，术后进行24 h动态心电图监测，根据Lown分级，分为心律正常组（0级，166例）和心律失常组（1～5级，104例）。

纳入标准：（1）均为ST段抬高型心肌梗死；（2）发病至PCI时间在12 h内；（3）心功能Ⅰ～Ⅱ级；（4）病人或其近亲属签署知情同意书。排除标准：（1）既往存在心律失常史者；（2）合并肝、肾功能障碍者；（3）合并恶性肿瘤者；（4）心脏瓣膜疾病、心肌病等病人；（5）心功能Ⅲ～Ⅳ级者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

Lown分级标准：共分6级。0级：无室性早搏发生；1级：室性早搏偶尔发生，每小时频率＜30次；2级：室性早搏频繁发生，每小时频率≥30次；3级：多形性和多源性室性早搏；4级：成对室性早搏或心动过速反复发生；5级：心室房颤或R on T现象。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集 病人于PCI术前采集5 mL肘静脉血，静置1 h，采用小型离心机（德国SIGMA公司，货号Sigma1-14）以3 500 r/min转速离心10 min（室温），取血清，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）法检测血清MALAT1、miR-1水平 取出血清，采用RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司，货号74004）提取血清总RNA，并逆转录为互补DNA（cDNA），利用所得cDNA配置qRT-PCR反应体系（20 μL）：上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green 10 μL，ddH2O 6μL，在ABI ViiATM7荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上扩增。2-ΔΔCt法计算血清MALAT1、miR-1的相对表达量。详细引物序列见表1。

表1 MALAT1、miR-1及对应内参GAPDH、U6引物序列

1.2.3 一般资料收集 收集所有病人一般资料，如：年龄、性别、身体质量指数、吸烟史、饮酒史、糖尿病、高血压、高血脂、收缩压和舒张压；彩色多普勒超声指标左心室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期内径（LVEDD）；心肌标志物肌酸激酶同工酶（CKMB）、心肌肌钙蛋白（cTnI）、血清N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）；冠脉造影罪犯血管部位及病变程度指标Gensini积分，Gensini积分=各支血管评分×权重系数（同一支血管多处病变，则积分累积）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0软件处理数据。计量资料如血清MALAT1、miR-1水平等以描述，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较行SNK-q检验；计数资料以例（%）描述，行χ2检验；Pearson法分析AMI继发VA病人血清MALAT1水平与miR-1水平的相关性；采用ROC曲线分析血清MALAT1、miR-1水平对AMI病人继发VA的诊断价值，曲线下面积比较行Z检验；logistics回归分析影响AMI病人继发VA的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组年龄、性别、身体质量指数、吸烟史、饮酒史、糖尿病、高血压、高血脂、心功能分级、收缩压和舒张压比较，均差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 两组心肌标志物、超声指标、冠脉造影罪犯血管及病变程度比较 心律失常组CK-MB、NT-proBNP、cTnI、LVEDD水平及Gensini积分、右冠脉病变比例明显高于心律正常组（P＜0.05），LVEF水平明显低于心律正常组（P＜0.05）。见表3。

表3 急性心肌梗死病人270例心肌标志物、超声指标、冠脉造影罪犯血管及病变程度比较

2.3 两组血清MALAT1、miR-1水平比较 心律失常组血清MALAT1、miR-1水平均高于心律正常组（P＜0.05）。见表4。

表4 急性心肌梗死病人270例血清MALAT1、miR-1水平比较/

表4 急性心肌梗死病人270例血清MALAT1、miR-1水平比较/

注：MALAT1为肺腺癌转录相关转录本1，miR-1为微RNA-1。

组别心律正常组心律失常组t值P值MALAT1 1.01±0.12 1.28±0.34 9.35＜0.001例数166 104 miR-1 0.99±0.10 1.24±0.33 9.12＜0.001

2.4 不同分级心律失常病人血清MALAT1、miR-1水平比较 血清MALAT1、miR-1水平由高至低依次为心律失常5级病人、4级病人、3级病人、2级病人、1级病人，心律失常5级、4级病人血清MALAT1、miR-1水平明显高于3级、2级、1级病人（P＜0.05），心律失常5级病人血清MALAT1、miR-1水平明显高于4级病人（P＜0.05）。见表5。

表5 不同分级心律失常病人血清MALAT1、miR-1水平比较/

注：MALAT1为肺腺癌转录相关转录本1，miR-1为微RNA-1。①与1级比较，P＜0.05。②与2级比较，P＜0.05。③与3级比较，P＜0.05。④与4级比较，P＜0.05。

miR-1 1.02±0.25 1.05±0.26 1.09±0.31 1.40±0.39①②③1.69±0.43①②③④15.06＜0.001不同分级1级2级3级4级5级F值P值例数17 22 26 19 20 MALAT1 1.04±0.27 1.08±0.29 1.12±0.30 1.45±0.40①②③1.76±0.47①②③④15.51＜0.001

2.5 AMI继发VA病人血清MALAT1水平与miR-1水平的相关性 Pearson法分析显示，AMI继发VA病人血清MALAT1水平与miR-1水平呈正相关（r=0.46，P＜0.001），见图1。

图1 急性心肌梗死继发室性心律失常病人血清肺腺癌转录相关转录本1（MALAT1）水平与微RNA-1（miR-1）水平的相关性图

2.6 血清MALAT1、miR-1水平对AMI病人继发VA的诊断价值分析 血清MALAT1、miR-1水平联合诊断AMI病人继发VA的曲线下面积高于二者单独诊断（Z=2.43、2.11，P=0.015、0.035）。见图2。

图2 血清肺腺癌转录相关转录本1（MALAT1）、微RNA-1（miR-1）水平、诊断急性心肌梗死病人继发室性心律失常的ROC曲线图

2.7 logistics回归分析影响AMI病人继发VA的因素 以AMI病人是否继发VA为因变量，以CK-MB、NT-proBNP、cTnI、LVEDD、LVEF、血清MALAT1、miR-1水平及Gensini积分、右冠脉病变为自变量，Logistic回归分析结果显示，高CK-MB、高NT-proBNP、高cTnI、高LVEDD、高Gensini积分、右冠脉病变、低LVEF及血清MALAT1高表达、miR-1高表达为AMI病人继发VA的独立危险因素（P＜0.05）。见表6。

表6 影响AMI病人继发VA的多因素logistic回归分析

3 讨论

AMI是一种严重的心血管危重急症且发病率逐年增加，严重威胁病人生命安全［6］。随着医疗技术的进步，PCI已广泛应用于临床，AMI救治成功率、病死率得到显著改善，但继发恶性VA发生率仍可达10%以上，影响病人治疗效果、增加猝死风险［7］。研究显示，对于继发恶性VA的AMI病人，其死亡风险为未继发恶性VA病人的3.3～6.0倍［8］。因此，寻找可早期识别AMI病人继发VA的生物标志物，并重点监护高风险病人，早期实施干预措施，对于改善AMI病人预后意义重大。

MALAT1是一种高度保守且主要在核内表达的LncRNA，表达于哺乳动物多种组织、细胞内，可调控细胞周期及表观遗传，同时在多种肿瘤细胞中高表达，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，参与血管生成［9］。近年来已证实，MALAT1在心血管疾病中发挥重要作用，但MALAT1在AMI中的作用仍存在争议。研究发现，MALAT1在AMI模型大鼠中表达升高，下调MALAT1水平可减少AMI大鼠的梗死面积及左心室内径，并提高左室射血分数缩短率，消除miR-125b-5p对AMI心肌细胞的保护作用［10］。另有研究表明，MALAT1在AMI小鼠心肌组织中表达增加，增加的MALAT1可保护心肌细胞免于凋亡［11］。然而，更多的研究则表明，AMI发生后MALAT1表达增加，但MALAT1的增加促进小鼠心肌细胞凋亡［12］。MALAT1可通过不同的miRNA靶标影响心肌细胞凋亡。在人体中，AMI病人的血液MALAT1水平高于健康对照，MALAT1有望成为诊断AMI的新生物标志物［13］。上述研究表明，MALAT1可参与AMI疾病进展过程，但MALAT1在AMI继发VA病人中的研究较少。本研究结果显示，AMI继发VA病人血清MALAT1水平高于未继发VA病人，心律失常5级、4级病人血清MALAT1水平明显高于3级、2级、1级病人，心律失常5级病人血清MALAT1水平明显高于4级病人，提示MALAT1参与影响AMI病人继发VA，可能通过促进心肌细胞凋亡、心肌纤维化，加重心功能恶化，继而引发VA［14］。

miR-1位于人20号染色体上，在心肌、肌肉组织中高度表达，可参与心脏发育过程，影响心肌细胞分化、凋亡，同时能够在心力衰竭、冠状动脉疾病等心血管疾病中发挥作用［15］。健康人群血浆中miR-1含量极低，AMI病人心肌细胞破裂导致miR-1进入血液循环，因此miR-1在血浆中的表达水平可用于反映心肌损伤程度及预后评估［16］。miR-1具有心肌特异性，与心肌梗死面积有关，在过氧化氢诱导的心肌细胞中，抑制miR-1水平可降低心肌细胞凋亡率，相反，过表达miR-1则促进心肌细胞凋亡［17］。缝隙连接蛋白43（Cx43）在心肌细胞中表达下降及分布异常可引起VA发生，Cx43表达下降可延长复极、减慢电传导速率，引发病理性折返回路，从而导致恶性VA，Cx43常被用于缺血性心律失常的预后评估［18］。研究表明，miR-1过表达可通过干扰细胞内运输系统引发VA，miR-1-3p可与Cx43的3'UTR区域结合，下调miR-1可防止Cx43水平下降及异常分布，使心脏免受缺血再灌注影响［19］。本研究结果与上述研究一致，AMI继发VA病人血清miR-1水平高于未继发VA病人，心律失常5级、4级病人血清miR-1水平明显高于3级、2级、1级病人，心律失常5级病人血清miR-1水平明显高于4级病人，结合前人研究结果推测miR-1可能通过调节Cx43表达及分布参与调节AMI病人继发VA的过程。

研究发现，miR-1是连接MALAT1-Cx43轴的介质，miR-1过表达减少Cx43表达，敲除MALAT1可抑制Cx43表达，MALAT1作为miR-1海绵RNA可抑制其对下游骨化相关基因的转录抑制作用［20］。本研究显示，AMI继发VA病人血清miR-1水平与MALAT1水平呈正相关，与前人研究不同。可能原因为MALAT1虽对miR-1为负调控，但术前时期MALAT1可能还通过调节其他生物学途径及因子水平间接影响miR-1水平升高，导致MALAT1、miR-1水平均处于较高水平，因此血清miR-1水平与MALAT1水平呈正相关；也可能因为MALAT1通过其他途径调控AMI继发VA病人血清miR-1表达，具体机制仍需进一步探究。

本研究结果还显示，与心律正常组相比，心律失常组CK-MB、NT-proBNP、cTnI、LVEDD水平及Gensini积分、右冠脉病变比例明显升高，LVEF水平明显降低，且高CK-MB、高NT-proBNP、高cTnI、高LVEDD、高Gensini积分、右冠脉病变、低LVEF是AMI病人继发VA的独立危险因素，提示AMI病人继发VA与心肌损伤、心脏功能减弱及冠脉病变程度加重密切相关。miR-1、MALAT1水平变化可能通过相关生物进程最终调节AMI病人心肌损伤、心脏功能及冠脉病变程度等影响VA继发。

此外，通过ROC曲线分析，血清MALAT1、miR-1水平预测AMI继发VA的曲线下面积分别为0.769、0.809，二者具有一定的诊断价值，但灵敏度均较低，联合预测可提高诊断AMI继发VA的曲线下面积及灵敏度，诊断效能更高。且血清MALAT1、miR-1高水平均为AMI病人继发VA的独立危险因素，提示需高度关注血清MALAT1、miR-1高表达病人，及早发现或预防，并采取相应治疗措施，降低病人病死率。

综上所述，AMI继发VA病人血清MALAT1、miR-1水平升高，二者均为AMI病人继发VA的独立危险因素，可用于诊断AMI病人是否继发VA，联合检测诊断价值更高。