环状RNA在肺动脉高压中的研究进展

黄殊伦，唐昊，吴艳

作者单位：无锡市人民医院、南京医科大学附属无锡人民医院呼吸与危重症医学科，江苏 无锡214000

肺动脉高压（PH）是由多种已知或未知原因引起的肺动脉压异常升高的临床病理生理综合征。随着病情的进展，PH会导致右心室负荷过重，右心室衰竭，最终导致死亡，是一种预后欠佳、病死率高、严重危害社会公众健康的疾病。肺动脉收缩和肺血管重构是PH的主要病理生理基础。肺血管由肺动脉内皮细胞（PAEC）、肺动脉平滑肌细胞（PASMC）等细胞构成。在免疫和炎症等内在因素或缺氧和药物等外界因素的影响下，PAEC、PASMC和成纤维细胞等出现异常增殖、代谢失调等情况，共同参与肺血管重塑、血管收缩过程［1-3］。目前，对PH的治疗以扩张血管为主，靶向药物因价格昂贵、适应证有限、副反应多等缺陷，在临床应用受到很大限制。因此需要深入研究PH的发病机制，寻找新的生物标志物和治疗靶点。

近年来，环状RNA成为探索各类疾病发病机制的研究热点。环状RNA广泛分布于各个器官系统，参与多种疾病的发生和发展。近年来研究发现，环状RNA对PAEC、PASMC等细胞的功能具有调控作用，参与PH的发生发展过程，有望为PH新型生物标志物和治疗靶点的开发提供理论依据。本研究就环状RNA在肺动脉高压中的作用机制综述如下。

1 环状RNA生物发生及功能

环状RNA是一种由外显子或内含子反向剪接形成的闭合环状RNA分子。和线性RNA相比，环状RNA不易降解，表达更稳定，且拥有更长的半衰期，这些特性赋予环状RNA作为生物标志物的潜能。其生物发生机制包括套索驱动的环化［4］、内含子配对驱动的环化［4］和RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP）驱动的环化［5］。环状RNA具有多种生物学功能：①海绵吸附作用，环状RNA能够靶向结合微RNA或RBP，从而调控它们的下游靶基因［6］；②编码蛋白作用，环状RNA能够充当一些短肽和蛋白质的翻译模板［7-8］；③调节线性RNA生成的作用，环状RNA由剪切形成，它的生成与线性RNA的剪切存在竞争关系，环状RNA和线性RNA通过竞争剪接位点来互相调节彼此的形成。此外，环状RNA还可以调控亲本基因的转录与表达［7］、作为分子支架募集生物分子［9］。

2 环状RNA调控PASMC功能

PASMC是构成肺血管壁的主要细胞之一，在缺氧和（或）遗传易感性等因素的影响下，出现凋亡抵抗、增殖活跃和钙化等异常特征［2］，参与PH的病理过程。

2.1 环状RNA与PASMC异常增殖 PASMC的异常增殖是肺血管重塑的重要特征之一，而环状RNA对PASMC增殖的调控作用是近年来PH研究领域的热点。在缺氧诱导的PASMC中，环状RNA-谷氨酸代谢型受体1（circ-Grm1）的表达量显著增高，circ-Grm1能够与PASMC中的肉瘤融合蛋白（fusedinsarcoma， FUS）结合（FUS是一种多功能RBP，在基因转录、细胞增殖和凋亡等过程中发挥作用［10-11］），所形成的复合物降低Grm1的稳定性并抑制其表达。Grm1表达降低后，其下游的抑制/激活蛋白-1通路受到抑制，细胞外信号调节激酶信号通路被激活，通过调控PASMC的增殖和迁移参与PH的发病机制［12］。人源性（homo sapiens， hsa）-circ-0002062的表达水平在低氧诱导的肺动脉高压组（HPH）小鼠和低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞（human pulmonary arterial smooth muscle cell，hPASMC）中显著增高，通过吸附hsa-miR-942-5p调控细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6， CDK6）基因表达，而CDK6基因与PASMC的细胞周期和增殖相关。敲低hsa-circ-0002062抑制了PASMC的增殖，过表达hsa-circ-0002062则出现相反结果，证实hsa-circ-0002062促进PASMC的增殖，参与PH的形成［13］。环状RNA-沉默信息调节因子1（circular RNA-Sirtuin1， circ-SIRT1）在HPH大鼠及大鼠低氧PASMC中呈低表达，过表达circ-SIRT1则可上调SIRT1，这一效应抑制了肺血管重塑相关的转化生长因子-β（TGF-β1）/母亲信号蛋白同源物3/母亲信号蛋白同源物7通路，从而抑制低氧诱导下大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，减轻低氧诱导大鼠模型的肺动脉高压［14］。研究发现，与不合并PH的慢性阻塞性肺疾病（COPD）病人相比，合并PH的COPD病人肺组织中hsa_circ_0016070水平显著增高，hsa_circ_0016070通过竞争性结合miR-942上调细胞周期蛋白1（cyclin D1， CCND1）的表达水平，从而促进PASMC的增殖和肺血管重塑［9］。最新研究证明，hsa_circ_0016070在PH病人的血清中也呈高表达，并发现hsa_circ_0016070调控miR-942/CCND1轴以外的作用机制。hsa_circ_0016070能够吸附miR-340-5p上调转录因子4（Transcription Factor 4， TCF4）的表达，上调的TCF4与β连环蛋白形成转录复合物，促进Twist相关蛋白1（twist related protein1，TWIST1）基因的转录，TWIST1通过促进PASMC的增殖迁移参与肺血管重塑的形成［15］。此外，环状RNA-钙调蛋白4［16］、小鼠源性（mus musculus， mmu）_circ_0000790［17］、circATP2B4［18］和hsa_circWDR37_016［19］等环状RNA均被证实能够促进PASMC的增殖，加速肺血管重构和PH的发生，而mmu_circ_0001033［20］具有相反的作用，抑制低氧诱导的PASMC增殖。可见环状RNA是PASMC增殖、迁移的重要调节因子，参与肺血管重塑和PH的发病机制。环状RNA在PH患肺组织或血清中表达的特异性以及其对PASMC增殖的调控作用，提示其有望成为PH的诊断标志物及潜在治疗靶点。

2.2 环状RNA与PASMC焦亡 焦亡是不同于凋亡的一种程序性细胞死亡形式，细胞发生焦亡时，质膜上迅速形成病理性孔隙，胞内胞外的离子梯度被破坏，细胞最终发生渗透性肿胀而破裂，释放促炎的细胞内容物，激活一系列炎症反应。PASMC焦亡参与了肺血管的重构［21］。circ-Calm4表达水平在HPH小鼠和小鼠低氧PASMC中均上调，上调的circ-Calm4通过海绵吸附作用与miR-124-3p相结合，游离的miR-124-3p减少而引起其下游的程序性细胞死亡蛋白-6水平升高，促进PASMC的焦亡及肺血管重构［22］。这一发现为PH的发病机制带来了新思路，有助于寻找新的诊断标志物和制定新的治疗策略来保护PASMC免受焦亡从而抑制PH的发生发展。

2.3 环状RNA与PASMC钙化 血管钙化是磷酸钙晶体在血管壁发生异位沉积的病理现象，常见于动脉粥样硬化、动脉瘤和脑卒中等心脑血管疾病［23-25］，其本质是血管平滑肌细胞由收缩表型向成骨细胞样表型的转化［26］。近年来有研究人员在PH病人的肺组织中发现肺血管钙化的证据，且PH患肺分离出的hPASMC存在向成骨细胞样表型的转化［27］，证实PASMC的钙化参与了PH的发生，但引起PASMC钙化的分子机制不完全清楚。环状RNA-小脑变性相关蛋白1反义转录物（circular RNA-antisense to the cerebellar degeneration related protein 1 transcript， circ-CDR1as）在缺氧处理的hPASMC中高表达，下调circ-CDR1as则抑制缺氧诱导的hPASMC钙化。Circ-CDR1as能够作为miR-7-5p的分子海绵，下调miR-7-5p的表达水平，而钙/钙调素依赖激酶Ⅱδ（calcium/calmodulin-dependent kinaseⅡ-delta， CAMK2D）和调宁蛋白3（calponin 3，CNN3）是miR-7-5p的下游靶基因。CAMK2D和CNN3驱动hPASMC向成骨细胞样表型转化而使之发生钙化，敲低CNN3和CAMK2D基因减少缺氧诱导的钙沉积，过表达CNN3和CAMK2D则具有相反效果［28］。circCDR1as/miR-7-5p/CAMK2D、CNNS这一途径能够诱导缺氧条件下hPASMC的钙化，引起肺血管病变，推动PH的发生发展。

2.4 环状RNA与PASMC钾通道活性降低 越来越多证据表明，离子通道是血管舒缩、细胞增殖或凋亡的关键调控因子。PASMC上钾离子通道水平的下调会引起肺血管收缩和血管重塑［29］。环状RNA对PASMC的钾离子通道具有调控作用。COPD合并PH病人全血中的hsa_circNFXL1_009水平显著下调，同样，在体外实验中，缺氧显著降低了hPASMC中hsa_circNFXL1_009的水平。hsa_circ-NFXL1_009表达减少会导致PASMC钾通道活性降低，该作用通过hsa_miR-29b-2-5p/钾电压门控通道亚家族B成员1（KCNB1）途径得以实现。hsa_circ-NFXL1_009对hsa-miR-29b-2-5p吸附作用的减弱引起下游KCNB1表达的减少，KCNB1表达水平的下调导致PASMC钾离子通道的活性下降，引起细胞膜持续去极化和L型电压门控钙通道的激活，驱使钙内流、细胞收缩，并最终导致肺血管持续收缩和血管重构［30］。

以上研究提示，环状RNA在PH中存在差异性表达，通过吸附微RNA或RBP调节不同的靶基因，导致PASMC的功能异常，最终引起PH，有望在PH的早期诊断和治疗中发挥作用。

3 环状RNA调控PAEC功能

PAEC是肺血管功能的主要调节因子，不同因素的刺激作用会引起PAEC过度增殖并释放血管内皮生长因子、内皮素-1等血管增殖因子，促进PASMC和成纤维细胞异常增殖，造成细胞外基质过度沉积，诱导肺动脉中膜及外膜增厚，最终导致肺血管重构。因此PAEC功能异常被认为是PH发生肺血管重构的始动环节［1］。环状RNA对内皮细胞的调控作用与动脉粥样硬化、肝细胞癌等疾病的发生、发展密切相关［31-32］。在PH中同样发现了环状RNA对PAEC的调控作用。与先天性心脏病肺动脉压正常病人相比，先心病和风湿性心脏病伴肺动脉高压病人血清中hsa_circ_0029642表达量减少，而hsa_circ_0029642与PAEC增殖调节相关的基因CRYL1相关，提示hsa_circ_0029642可能通过调控PAEC的增殖参与PH的形成［33］。HPH大鼠中环状RNA的N6-甲基腺苷甲基化（N6-methyladenosine，m6A）水平显著降低，且缺氧条件下培养的PAEC中m6A修饰的circXpo6和circTmtc3显著低于未经缺氧处理的PASMC，推测m6A修饰的环状RNA在缺氧条件下对PAEC的功能有调控作用［34］，具体机制有待进一步探索。此外，血小板源性生长因子诱导的人肺动脉内皮细胞（human pulmonary arterial endothelial cell，hPAEC）中circHIPK3的表达显著增多，circHIPK3通过海绵吸附作用降低miR-328-3p的表达水平，引起靶基因转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表达升高，进而促进hPAEC的增殖、迁移和血管生成，参与了PH的病理过程［35-37］。环状RNA-γ-分泌酶激活蛋白基因（circ-GSAP）在特发性肺动脉高压病人肺组织、PH大鼠和缺氧诱导的肺微小动脉内皮细胞（PMEC）中均下调，过表达circ-GSAP能够抑制PMEC的增殖和迁移［38］。上述研究表明，环状RNA能够促进或抑制PAEC增殖、迁移或促进血管生成，有成为PH新型诊断指标及治疗靶标的潜力。

4 环状RNA调控免疫细胞功能

免疫炎症在PH发生过程中起着重要作用。在损伤、异物等因素的作用下，淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等免疫细胞被激活，产生多种炎性介质、细胞因子作用于PASMC和PAEC等细胞，诱导血管重塑并形成PH。环状RNA参与PH发病的机制与免疫细胞也具有相关性。circ_0022342和circ_0002062在慢性血栓栓塞性肺动脉高压病人中显著升高，其中circ_0022342可能通过miR-503-5p/溶质载体家族2成员3调控嗜酸性粒细胞的功能，而circ_0002062可能通过miR-92b-3p/人甘露糖苷酶-α2A类成员1信号轴对调节性T淋巴细胞发挥调控作用，共同参与PH的形成，有望为PH的免疫调节治疗提供新思路［39］。

5 环状RNA调控心肌细胞功能

PH的发展进程中伴随不同程度的右心室肥厚（RVH），主要表现为心肌细胞体积增大、重量增加，是右心室对肺动脉压力增高的一种适应性反应，随着肺动脉压的增高，超出心肌代偿范围，右心室肌肥厚将发展为右心衰竭甚至导致猝死，增加了PH病人的病死率。环状RNA可作为诊断PH病人右心室肥厚的潜在生物标志物。与PH（+）RVH（-）组病人相比，PH（+）RVH（-）组病人中环状RNA-0068481表达水平显著增高，miR-646和miR-570表达水平显著降低。心肌细胞中环状RNA-0068481通过吸附miR-646、miR-570或miR-885调控人眼缺失基因（eyes absent 3，EYA3）的表达［40］。EYA是一种和眼球生长有关的基因，既往研究表明EYA能够促进内皮细胞增殖和血管生成，抑制EYA3的酪氨酸磷酸酶活性可以逆转肺血管重塑［41］。上述研究提示，环状RNA-0068481参与了PH中右心室肥厚的发生发展，对PH病人右心室肥厚的诊断有一定预测作用。环状RNA对PH的调控作用列于表1。

表1 环状RNA对肺动脉高压的调控作用

6 总结和展望

PH是一种不易被早期发现的慢性进行性疾病，其发病率和病死率高，尚缺乏有效的防治措施，在诊断和治疗方面任重而道远。近年来随着高通量测序技术的发展，发现环状RNA与PH的发生发展具有密切关系。环状RNA对PASMC、PAEC等细胞的增殖、凋亡和代谢等功能具有调控作用，参与肺血管重塑和PH的病理过程，为PH的诊断与治疗提供了新的线索。截至目前，虽然研究发现的PH中差异表达的环状RNA不在少数，但只有部分环状RNA的功能和机制得到深入研究，很多环状RNA参与PH发生发展的具体机制尚不清楚。此外，大部分研究聚焦于环状RNA作为分子海绵吸附微RNA这一功能，关于环状RNA作为分子支架募集生物分子、编码短肽或蛋白质等其他功能的研究较少，且在PH的研究中环状RNA调控PASMC功能的研究较多，而对其他相关细胞的调控机制研究偏少。鉴于以上，环状RNA在PH中的作用机制需要进一步探索，以期为PH的诊治提供新的靶点和分子标志物。