王玉华,朱瑞娟,王晓环,王俊青,孙新堂,2,王成森,2
(1.山东畜牧兽医职业学院,山东 潍坊 261061;2.潍坊市兽用生物发酵技术重点实验室,山东 潍坊 261061)
芦丁水解可制备槲皮素,槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等生物活性[1],应用前景较广。目前,检测芦丁或槲皮素的技术手段有高效液相色谱法[2]、液-质联用法[3]、荧光法[4]、电化学分析法[5,6]等。相比之下,电化学分析方法用到的检测设备成本低,仪器操作简单,响应快,检测过程较少用到有毒有害挥发性试剂[7]。
石墨烯(graphene,GR)具有优良的导电性[8],是常见的电极修饰材料,但分散于水溶液时易发生不可逆团聚[9],导致导电性能下降。氧化石墨烯(graphene oxide,GO)层间的含氧基团产生静电斥力使其在水溶液中较稳定的存在,GO修饰于电极表面后,再通过电还原制备GR[10]可避免GR的团聚,从而较好地保留GR 的优异性能。另外,基于GR的纳米复合材料展现出了更好的电催化活性、灵敏性和选择性[11,12]。
本文首先将GO修饰碳糊离子液体电极(CILE),干燥后浸于氯金酸(HAuCl4)溶液中,于阴极电位下进行恒电位沉积,金(Au)被沉积在电极表面,同时GO也被原位还原,从而构建了基于Au增敏GR复合材料的Au-rGR/CILE 电化学传感器,Au-rGR/CILE 在芦丁的检测中展现了较高的催化性和选择性,获得了检测芦丁的工作曲线。AurGR/CILE能实现对芦丁和槲皮素的同时检测,进一步应用于芦丁水解为槲皮素的在线检测,为黄酮类活性成分的定性定量检测提供参考。
石墨粉(≥98.5%,西陇科学股份有限公司);液体石蜡(分析纯,烟台远东精细化工有限公司);正丁基吡啶六氟磷酸盐(BPPF6,>99%,中科院兰州物化所);HAuCl4(麦克林);芦丁(分析对照品,麦克林);GO,根据文献[13]合成);不同pH值的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)作为支持电解质;蒸馏水。
电化学工作站(上海辰华CHI660E型);工作电极(AurGR/CILE);参比电极(饱和甘汞电极);对电极(铂(Pt)电极);扫描电子显微镜(日本电子公司JSM-6700F型);酸度计(上海雷磁pHS-3E型)。
根据文献[14]制备CILE 作为基底电极。将GO 分散于蒸馏水中,超声15 min得到0.8 mg/mL的GO分散液。取10 μL 上述分散液滴涂于CILE 表面,晾干后浸入含2.0 mmol/L HAuCl4的PBS 中,磁力搅拌下于-1.50 V 电位下恒电位沉积300 s,蒸馏水冲洗后N2吹干,一步构建得到Au-rGR/CILE。rGR/CILE在空白PBS 中按相同步骤制得。
以铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])为分子探针对3 种电极进行循环伏安表征,结果如图1 所示。CILE 上氧化还原峰电流(Ip)信号较小;在rGR/CILE上的电流信号增加了约为裸电极的3倍,说明电还原得到的GO具有优良的导电性,能加快分子探针在电极表面的电子转移速率。Au-rGR/CILE上的Ip信号较CILE和rGR/CILE均有增加同时峰电位差减小,表明Au 纳米粒子产生了增敏效应,与GR 共同提高了电极的导电性和催化性。
图1 CILE,rGR/CILE和Au-rGR/CILE的循环伏安曲线(扫速100 mV/s)
图2 为扫描电子显微镜对CILE、rGR/CILE、Au-rGR/CILE表面形貌的扫描电镜图。由图中可看出,图2(a)的界面较为紧密均一,说明石墨粉被液体石蜡和离子液体均匀粘合。图2(b)的界面呈现出折叠和褶皱,明显与图2(a)的不同,说明GO可在恒电位条件下被还原。在图2(c)的界面上,可看到Au纳米颗粒和GR 相互穿插,能够增加电极的比表面积。
图2 CILE,rGR/CILE,Au-rGR/CILE的扫描电镜图
图3 (a)为50 μmol/L芦丁在不同pH值(1.5~5.5)下PBS中的电化学行为。由图可知,缓冲溶液pH 值增大,芦丁的氧化还原峰电位同时发生负移,pH值2.0 时芦丁的电信号最大。pH值1.5~5.5 范围内,势电位(E0′)与pH 值呈线性关系,线性回归方程为E0′(V)=-0. 059 9pH +0.671(γ2=0.987),方程斜率接近理论值-0.057 6 V/pH,表明芦丁在Au-rGR/CILE上的电化学反应过程是等电子等质子的。
图3 50 μmol/L芦丁在Au-rGR/CILE上不同pH值、扫速下的循环伏安曲线
图3(b)为50 μmol/L的芦丁在不同扫速(0.03~0.3 V/s)下的循环伏安行为,由图可知,扫速(v)增大,氧化峰电流(Ipa)和还原峰电流(Ipc)增大,并伴随着氧化峰正移(Epa)和还原峰负移(Epc)。线性回归方程为Ipa=-241.7v1/2+27.97(γ2=0.976),Ipc=215.5v1/2-28.67(γ2=0.993)。峰电压(E)与扫速的自然对数(lnv)的线性回归方程为Epa=0.010 9lnv+0.617(γ2=0.978),Epc=-0.009 17lnv+0.513(γ2=0.976)。根据公式
式中α为电子传递系数,n为电子转移数,ks为表观异相电子转移速率常数。结合线性方程计算各电化学参数,得到α为0.54,ks为2.77 s-1,n为2。
以上说明芦丁在Au-rGR/CILE表面上的电极反应是两电子两质子的扩散控制过程。
图4(a)为pH值2.0,扫速0.1 V/s条件下,芦丁在AurGR/CILE上的微分脉冲伏安(differential pulse voltammetry,DPV)曲线。图4(b)为在0.06~50.0 μmol/L 内,工作曲线为Ipa=0.505c+1.17(γ2=0.988);在50.0~400 μmol/L内,工作曲线为Ipa=0.272c+16.0(γ=0.999),检测限为0.017 μmol/L(3σ),低于报道值 0. 03 μmol/L[15],0.028 μmol/L[16],0.07 μmol/L[17],表明Au-rGR/CILE 对芦丁的检测具有较高的灵敏度。
芦丁在酸性介质中可以水解得到槲皮素,芦丁酸性条件下的水解反应式如下
图5 为芦丁和槲皮素在pH值2.0 PBS中的DPV曲线,两者的氧化峰电位差约为100 mV,说明Au-rGR/CILE对芦丁和槲皮素能实现同时检测,可为芦丁的水解产物提供定性分析依据。
图5 芦丁和槲皮素标准品的DPV曲线
准确称取芦丁0. 3 g,溶于到100 mL 80 %甲醇+0.5 moL/L HCl溶液中,80 ℃下水浴回流加热,每隔一定时间,移取水解混合液冷却终止水解反应,取400 μL 水解混合液,定容于10 mL pH值2.0 PBS中进行检测。图6(a)为不同水解时间下水解液的DPV曲线,由图可见,随着水解时间的增加,芦丁的响应信号逐渐减小,伴随槲皮素的响应信号逐渐增加,说明芦丁不断水解产生了槲皮素。以ln(c/c0)对水解时间进行线性拟合,线性方程为ln(c/c0)=0.124 -0.962t(γ=0.989),水解反应速率常数为0.962 h-1,说明芦丁的水解符合一级动力学反应模型,为芦丁水解过程中浓度的变化进行定量分析提供依据。
图6 水解过程在线检测结果
按1.2的步骤制备5支Au-rGR/CILE进行循环伏安扫描,电流信号的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)小于4.7%;室温保存2周后,测得的电流信号为不低于原先的95.5%,表明自制电极的重现性和稳定性较好。
采用恒电位法制备了Au-rGR 复合膜修饰CILE,利用该修饰电极获得了检测芦丁的工作曲线,检测浓度范围为0.06~400. 0 μmol/L,检测限为0. 017 μmol/L(3σ),表明Au-rGR/CILE对芦丁的检测具有较高的灵敏度。在温度80 ℃下,80%甲醇+0.5 mol/L HCl 溶液中,芦丁的水解符合一级反应动力学模型,水解常数为0.962 h-1,为芦丁水解过程中黄铜类物质的定性定量检测提供参考价值。