川崎病生物标志物组学研究与临床转化

黄敏

川崎病是一种好发于5岁以下儿童的急性发热性疾病，其主要病理特征为中小动脉血管炎，侵犯冠状动脉（简称冠脉）可引起冠脉扩张和动脉瘤，远期可发生狭窄性病变、AMI乃至猝死，已成为发达国家儿童获得性心脏病的主要病因之一。目前，川崎病的诊断仍依赖临床特征的组合，受评估者主观判断影响，早期明确诊断困难，易遗漏症状、体征不典型的不完全性川崎病，部分确诊患儿对静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治疗反应不敏感，诊治的延误进一步导致冠脉病变发生风险升高，损害患儿健康，给患儿家庭带来经济负担[1］。因此，寻找生物标志物作为诊断“金标准”是临床上川崎病诊治亟待解决的问题，探索特异性治疗靶标是实现川崎病精准医疗的必然方向。

近年来，研究者们借助高通量测序和质谱技术，对川崎病患者的血浆、尿液、外泌体、组织细胞，以及相关动物模型中的物质进行测定和组学分析，积累了大量生物信息数据。目前，主流观点认为川崎病是遗传易感个体受病原刺激后免疫系统异常激活触发的炎症风暴，其中蕴含着复杂的多信号交互机制，尤其适合开展组学研究，系统性分子特异性变化的过程正是遗传和环境交互作用的结果。组学为全面了解川崎病发病机制、发掘生物标志物提供了丰富的数据资源，与此同时，数据的爆发增长也使研究者面临重大挑战，即如何从海量的数据中获取对科学探索和转化应用有价值的关键信息；如何使实验设计更趋合理，选用最适宜的前沿技术以充分利用珍贵的临床样本，节约成本；如何将计算机技术与生物信息深度融合以实现更深层次的数据挖掘，这些都是科学技术发展带来的难点和痛点。

1 基因组学

基因组学研究提供了川崎病遗传易感性、IVIG治疗敏感性、冠状动脉损伤（coronary arterylesion，CAL）发生风险和疾病严重程度的相关信息。全基因组关联分析（genome wide association study，GWAS）对大规模群体DNA样本进行高密度遗传标记分型，包括单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和拷贝数变异（copy number variation，CNV）等，揭示基因与表型的关联。目前研究较多的川崎病易感基因有1，4，5-三磷酸肌醇3激酶C（inositol-1，4，5-trisphosphate3-kinase C，ITPKC）、FCGR2A、半胱天冬蛋白酶3（cysteiny laspartate specific proteinase 3，CASP3）、B淋巴酪氨酸激酶（B lymphoid tyrosine kinase，BLK）、CD40和HLA等。ITPKC作为钙离子（Ca2+）／活化的T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）通路的第二信使，可抑制T细胞活化，CASP3编码caspase-3调控未成熟细胞凋亡，FCGR2A在树突状细胞、单核细胞等多种免疫细胞表面表达低亲和力IgG抗体Fc段受体，BLK则参与B细胞受体信号转导，且对小鼠体内γδT细胞发育起关键作用，CD40表达于B细胞、单核或巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和脂肪细胞表面，这些基因多态性引起免疫细胞异常激活，细胞因子释放，ITPKC和CASP3遗传变异的协同作用可能导致IVIG无应答或高CAL风险的发生[2］。尽管已经鉴定出大量川崎病相关的遗传变异位点，但只有少数研究得出一致的关联性，多数易感基因与川崎病的关联在不同地区、种族或性别的研究中显示出不同的结果，不同人群间风险等位基因频率亦存在差异。目前，川崎病易感基因研究可解释一部分川崎病流行病学特征和发病机制，但其在临床场景中用于早期诊断的证据尚不充分，其临床转化更多指向高危人群的筛选，指导特异性药物的应用。FCGR2A基因功能研究为明确IVIG治疗川崎病的效应原理提供了生物学基础，Ca2+／NFAT通路抑制剂他克莫司和环孢素A或可作为IVIG无应答者的补救治疗。

DNA是生命体遗传信息的承载者，随着遗传学研究的进展，研究者们发现表型不仅由基因完全决定，在不改变DNA序列的情况下对基因进行的各种修饰同样影响着个体的分化发育和疾病进程，聚焦基因表观修饰的研究被称为表观基因组学。DNA甲基化是最早被发现、最为典型，也是川崎病中研究最为广泛的表观修饰方式，甲基与基因组胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（Cp G）岛共价结合，调节基因表达，低甲基化水平可引发基因活化增强。川崎病相关基因大多处于低甲基化状态，集中呈现在炎症反应、先天免疫反应和凝血反应，以及血小板活化、破骨细胞分化和趋化因子信号途径等通路，与川崎病全身高炎症状态和冠脉病变形成相关。ITPKC启动子区域甲基化与参与NLRP3炎性小体激活[3］，FCGR2A启动子甲基化与川崎病易感性和IVIG治疗结果之间存在显著关联，其启动子Cp G位点甲基化水平可作为IVIG治疗方案优化的重要指标[4］。通过比较川崎病患儿接受IVIG治疗前后的DNA甲基化改变，已证明IVIG可能通过减少Cp G标志物以抑制免疫炎症的发生[5］。鉴于DNA本身性质的稳定性和可扩增性，随着表观遗传学研究的深入和技术的进一步发展，可以预见川崎病基因启动子异常甲基化的检测在早期诊断和IVIG治疗的敏感性预测等领域具有广阔的应用前景。

2 转录组学

转录组学是研究细胞表型和功能的一个重要手段，转录组测序的研究对象是特定细胞在特定条件下转录出来的所有RNA的总和，主要包括传统转录组学所指的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和近年研究火热的非编码RNA。川崎病患儿冠脉组织转录谱表现出抗病毒反应特征，包括细胞毒性T细胞的活化和I型IFN诱导的信号通路上调[6］，这一发现支持川崎病的病毒病原学说，并为潜在的致死性冠脉病变高危患儿的免疫调节治疗提供了方向。IVIG无应答与冠脉病变发生高度相关，目前转录组学研究尚未分离到有效预测IVIG反应性的生物标志物，更具分辨力的优化算法或可破解这一困局。对于样本量较多的复杂转录组数据，加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）可鉴定表达模式相似的基因集合，并鉴别模块中权重最高的核心基因，研究者利用这一技术发现，髓系细胞激活与川崎病患儿的IVIG无应答相关，转录因子IL1R2、GK、HK3、C5orf32、CXCL16、NAMPT和EMILIN2在共表达网络中发挥关键作用[7］。Rambabu等[8］通过定义基因表达的“开”“关”开发了一种名为布尔分析的方法，发现外周血单核细胞代谢在IVIG无应答中起到了至关重要的作用。若能对这些代谢参数开展快速测定，或可帮助临床医师早期识别IVIG无应答者，启动替代治疗，降低冠脉病变发生风险和治疗成本。

微RNA（microRNA，miRNA）是川崎病领域研究最广泛的非编码RNA，作为一种长约20 nt的单链RNA，可与靶向m RNA直接结合，参与转录后水平的基因调控。大量研究[9-11］数据显示，川崎病患儿体内失调控的miRNA集中参与了TGF-β信号通路、内皮-间充质转化（Endo MT）、凋亡相关信号、免疫相关信号转导等过程，提示miRNA调控在川崎病的发生、发展中发挥重要作用。miRNA在体液中普遍易得，检测方法成熟，具有成为生物标志物的巨大潜力，但由于尚未鉴定出足以用于川崎病诊断的单一miRNA，目前的开发多为基于数个miRNA结合的诊断面板或合并临床指标构建诊断模型[12-13］，而现有的研究结论多来自单中心、同种族人群，样本数量和来源限制了诊断效能的提升和模型的推广应用。外源性给予miRNA类似物或抑制物为实现川崎病靶向治疗提供了新的思路，但是以miR-223为例，综合多项研究[14-19］结论显示，其经由不同细胞组织来源和效应通路在川崎病进程中发挥了迥异的作用，未来应进一步明确miRNA在川崎病患儿体内的作用网络和真实效应，为基于miRNA的靶向药物开发提供更可靠的有效性和安全性证据。

传统的转录组测序是在多细胞基础上进行的，其得到的是样本组织或细胞群中所有转录产物的平均水平，丢失了细胞异质性的信息，常忽略丰度较低亚群的表达特征。单细胞测序技术克服了这一弊端，从体液或混杂组织中捕获单个细胞，高分辨率地识别生物组织中以细胞为单位的转录组信息，为全面揭示各亚群特异性变化和基因的时空分布提供了有力工具。本课题组首次应用单细胞转录组测序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）技术绘制了川崎病患儿外周血单个核细胞免疫图谱，结果显示，相较于健康对照组，单核细胞是IVIG治疗前主要的差异表达基因来源，治疗后可见B细胞丰度下降伴浆细胞比例升高，B细胞受体（B cell receptor，BCR）寡克隆扩增，以及Ig M／Ig D向IgG／Ig A的同型转化，提示B细胞分化发育异常在川崎病的发生、发展和IVIG应答中扮演重要角色，此外T细胞受体（TCR）和BCR测序结果颠覆了以往对川崎病病原学的认知，提示其免疫激活更可能由特定抗原而非超抗原引发[20］，但后续Fan等[21］开展的scRNA-seq结果显示川崎病患儿B细胞减少而自然杀伤细胞增多，这与本课题组研究的结论不一致，可能是受到样本量的限制。目前，sc RNA-seq技术还存在诸多问题与争议，高昂的成本使其大规模应用难以实现，完全基于机器学习算法的聚类和分析得到的生物学意义可靠性有待商榷，表达谱层面的解释距离临床价值还相去甚远。目前公开发表的川崎病scRNA-seq数据样本来源单一，以外周血单个核细胞为主，对照组仅有健康和感染性发热，IVIG治疗无应答川崎病患儿的单细胞基因表达情况尚为空白，未来应当收集更多病程阶段和临床亚型的病例样本，设置包括各类血管炎、自身免疫性疾病等在内的丰富对照，优化数据分析方法和流程，对已有数据开展更具深度和临床意义的挖掘，驱动科研成果向技术应用转化，指导川崎病精细分型和精准诊疗。

3 蛋白质组学

蛋白质组学的研究对象是特定时间、空间下生物体、组织或细胞全部蛋白质的集合，旨在探索其组成、结构、功能和相互作用。与基因组和转录组相比，蛋白质作为生命活动的执行分子，能更直接反映机体生物学功能和动态变化。蛋白质组学技术包括分离、鉴定和定量，以及后续的生物信息分析处理，目前最主流的是基于质谱技术的定量蛋白质组学研究，常用定量方法包括蛋白质非标记定量技术（label-free）、iTRAQ／TMT、DIA／SWATH等。近年来，蛋白质组学已广泛应用于常见的心血管系统疾病如高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、扩张型心肌病等。

血浆蛋白标志物一直是临床场景下分子诊断的主力军，以氨基末端脑利钠肽前体（NTproBNP）为代表的经典指标可提示川崎病活动但诊断特异性明显不足，因此迫切需要开发更具代表性的蛋白质分子。借助日新月异的蛋白质组学技术，研究者们现已鉴别出与川崎病相关的多种蛋白质，这些蛋白质在炎症、免疫应答、血管生成和内皮细胞损伤等过程中发挥作用。S100A蛋白家族与炎症和免疫调节相关，多个S100A蛋白家族成员的水平在川崎病急性期升高，其中S100A12受到较多关注，S100A12与sRAGE的比值可能有助于评估IVIG无应答的风险[22］；S100A4体外引起内皮细胞松散，更易受中性粒细胞侵袭，有希望成为川崎病冠脉病变标志物及潜在治疗靶点[23］。其他筛选出的川崎病相关血浆蛋白还包括甲状腺素转运蛋白（TTR）、脂多糖结合蛋白（LBP）和富含亮氨酸糖蛋白（LRG1）等[24-25］，尽管这些分子的表达丰度达到了微阵列ELISA检测的要求，能够实现快速准确定量，具备临床应用的潜质，但其对川崎病的鉴别诊断效能还有待进一步验证。此外，在以寻找临床生物标志物为导向的蛋白质组学研究中，尿液样本具有独特优势，因其取样过程完全无创，可重复性高，且尿液蛋白质成分简单，易于检测分析，是标志物分子的良好来源。尿液蛋白质组学技术已鉴定出免疫调节分子meprin A、内皮和心肌损伤相关蛋白细丝蛋白c在川崎病患儿尿液中高表达，无论是从疑似患者中识别川崎病，还是对不典型患者明确诊断层面，上述分子均展现出良好的效能，优于目前使用的实验室指标ESR和CRP[26］。

外泌体是一种直径为30～100 nm的细胞外囊泡，内容物包含丰富的RNA、蛋白质和脂质成分，参与细胞间通讯。脂质双分子层的保护作用使得外泌体能在体液内稳定存在，维持内容物的理化性质，颇具临床诊断价值。与细菌感染性患儿相比，川崎病患儿血清外泌体差异蛋白在补体和凝血级联反应中显著富集，候选蛋白纤维蛋白原γ（FGG）和补体成分1q子成分c（C1QC）有望成为川崎病的补充诊断标志物[27］。比较川崎病患儿接受IVIG治疗前后血清外泌体的蛋白质分布发现，补体C3、载脂蛋白A-Ⅳ和胰岛素样生长因子结合蛋白复合酸不稳定亚基存在差异，或可用于IVIG疗效监测[28］。伴冠脉病变的川崎病患儿血清外泌体中TN、LRG1、RBP4和APOA4差异表达，这些蛋白质参与了免疫、炎症、发育、凋亡和黏附等生物学过程，但尚未证明其与冠脉病变有特异性相关，现有研究较小的样本量可能掩盖了两者关联的真实性[29］。

4 代谢组学

核酸和蛋白质是生物学过程发生的基础，但基因组、转录组和蛋白质组的分析结论对功能状态仅有提示作用，体内代谢物的变化才是生物事件的真实反映。代谢组学是研究生物体被扰动后代谢产物种类、数量及其变化规律的科学。目前，川崎病代谢组学研究仍处于起步阶段，主要围绕脂代谢开展。日本的一项前瞻性研究[30］全面分析了一组川崎病患儿的血清脂质成分并在独立队列中开展验证，发现急性期氧化磷脂酰胆碱（Ox PC）表达水平升高，氧化磷脂炎症信号的激活参与了冠状动脉炎的发生，但这一研究结论仅来自日本人群，未来应扩大样本的种族和地区来源，以探索Ox PC及其相关产物在广泛人群中用于冠状动脉瘤预测的可能性。在IVIG反应性方面，一项基于液相色谱液质谱法（LC／MS）的脂质组学研究[31］数据显示，IVIG敏感组和中等反应组脂质谱表达模式相似，但IVIG耐药组脂质成分在治疗前后有显著差异，其中溶血磷脂酰胆碱（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）在治疗前后的差异最大，可用于川崎病患儿IVIG反应性分层，两者与Gunma评分结合显著增高了对IVIG无应答的诊断效能，因此，测定血清LPC和LPE有助于在治疗前实现对患儿IVIG反应性的准确评估。未来，应扩大川崎病代谢组学研究范围，纳入其他小分子代谢物如氨基酸、有机酸、核苷酸等，深入分析川崎病表型与各种代谢变化的关联，发掘代谢标志物以指导川崎病诊断分型、CAL风险预测、疗效与安全性评估等临床应用。然而，目前的分析技术所能检测并注释的代谢物种类数量非常有限，生物机体本身就是一个动态的、多因素调控复杂体系，地理、气候、药物等外界因素，以及种族、遗传背景、健康状况等内在环境都会引起代谢物的联动变化，对代谢物的简单检测可能很难精确反映川崎病的病程状态。

5 展 望

自1967年日本学者川崎富作首次报道川崎病，50余年来随着技术的不断进步和科学家的不懈探索，对川崎病的认识已经贯穿整个基因表达过程，一方面，现在比以往任何时候都更加接近川崎病发病的真相；另一方面，临床上川崎病诊疗仍有许多悬而未决的难题，早期诊断是减轻疾病负担的首要任务，也是目前临床实施最为困难的环节。2017版美国心脏协会（AHA）《川崎病的诊断、治疗和长期管理：美国心脏协会给卫生专业人员的科学声明》[32］中明确要求诊断川崎病需满足发热≥5 d这一条件。而最新的日本《川崎病诊断指南（第6次修订版）》[33］已删除对特定热程的要求，并将卡介苗瘢痕发红纳入早期临床特征。我国2022年发布的《川崎病诊断和急性期治疗专家共识》[34］采用了日本指南的部分更新，但对不完全川崎病的诊断仍要求满足发热≥5 d这一条件。因此，目前仍没有一套能在不同种族和地区推广的统一标准流程可帮助临床医师快速、准确诊断川崎病，寻找生物标志物或是解开这一困局的最佳答案。人类基因组计划如一阵春风将组学研究吹拂到医疗科学的各个领域，川崎病特异性生物标志物开发迎来了前所未有的浪潮，大量不同分子水平的生物信息极速累积，运算能力不断飞跃，DNA、RNA、蛋白质、代谢产物等各种新标志物层出不穷。但在热潮之下，研究者们仍需冷静思考，过度膨胀的生物数据应用价值如何，套路化的分析流程是否使结论假象丛生；标志物从实验室走向临床实践的过程中还面临着鉴定方法不便捷、诊断效能不稳定等问题；单一组学标志物在川崎病准确诊断方面尚无突破性进展，多组学信息整合分析或可弥补这一不足，但又存在价格高和用时长的劣势，目前在临床应用的性价比较低。对于已经开发的生物标志物，未来应当扩大样本量、纳入多种族人群、增加对照类型、联合多中心数据进一步验证，加入微生物组、空间组等扩大数据类型，继续推进单一标志物开发，优化现有模型提高特异度和灵敏度以达到临床应用要求，多路径实现川崎病的早期精确诊断，预测治疗反应性以尽早启动替代治疗，减少心血管事件发生风险，使患儿及其家庭真正受益。