铁皮石斛种子组培繁育技术

董 薇,余永亮,杨红旗,许兰杰,谭政委,杨 青,李 磊,安素妨,鲁丹丹,梁慧珍

(河南省农业科学院芝麻研究中心,河南郑州 450002)

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale),又名黑节草,为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)植物,铁皮石斛是珍贵的中草药,具有极高的保健功效,性甘,微寒,归胃、肾经,益胃生津,滋阴清热[1]。铁皮石斛是我国珍贵的国家级二级保护植物,对生长环境要求苛刻,自然繁殖率很低,常规分株扦插等繁殖方式效率低,耗时长,不能满足生产需要,因此大多采用组织培养方式繁殖铁皮石斛种苗以满足生产需求[2-6]。该研究以河南铁皮石斛的种子为外植体,以马铃薯泥为培养基添加物,对种子组培实生苗的培养过程加以优化,为河南铁皮石斛种质资源开发及工厂化育苗提供理论和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料铁皮石斛种子采摘自河南省农业科学院玻璃温室,人工授粉后选择八成熟的蒴果。

1.2 培养条件该试验采用1/2MS、MS为基本培养基,附加不同浓度6-BA、NAA、马铃薯泥,培养基中蔗糖为30 g/L,琼脂为6 g/L,pH为5.8～6.0。培养条件为温度(25±2)℃,光照2 000 lx,时间16 h/d。

1.3 试验方法

1.3.1材料消毒。将铁皮石斛蒴果先用毛刷在流水下洗净,在超净工作台上,先用75%乙醇浸泡30 s,再用84消毒液浸泡10 min,用无菌水冲洗3～4次后置于无菌滤纸上晾干水分。

1.3.2种子萌发。用剪刀剪开一端,将种子倒在灭菌水里,每瓶用移液枪吸取1 mL均匀撒在诱导培养基上。以1/2MS+10 g/L马铃薯泥作为基础培养基,添加不同浓度的NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L),分析不同浓度激素组合对铁皮石斛种子萌发的影响。每个处理10瓶,重复3次。暗培养3 d促进种子萌发,随后光照培养。

1.3.3原球茎增殖分化。将种子萌发获得的原球茎接种在继代培养基上。有机添加剂可以减少新生组织褐化并促进原球茎增殖,继代培养基以MS为基础培养基。添加不同浓度激素组合6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)、NAA(0.3、0.5、1.0 mg/L)和有机物(20、40、60、80 g/L马铃薯泥),观察每种培养基中原球茎增殖情况。每处理20瓶,每瓶接种5个原球茎,3次重复,培养45 d后统计增殖情况,培养90 d后统计原球茎分化生长情况。

1.3.4生根壮苗。选取继代增殖中3 cm左右、长势一致的幼苗,转接至生根培养基中,以MS+1.0 g/L活性炭为基础培养基,添加不同浓度NAA和马铃薯泥,每种培养基接种20瓶,每瓶接5株,3次重复,培养90 d。

1.3.5炼苗移栽。当生根苗长至3～5 cm且有3～4片叶时,即可炼苗移栽。将培养瓶置于温室炼苗7 d,取出试管苗,用清水洗净幼苗根部培养基,置于通风阴凉处1 h晾干水分。将炼苗后的试管苗移栽到松树皮基质中并浇透水,之后基质保持一定湿度即可。铁皮石斛喜湿、耐寒,移栽环境需阴凉,避免阳光直射,空气相对湿度不低于80%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度激素对铁皮石斛种子萌发的影响培养10 d后,陆续可见铁皮石斛种子萌发,种胚黄绿色并逐渐增大,培养28 d后,大部分种胚颜色转绿并进一步膨大,可见圆锥状叶原基。统计结果(表1)表明,4种培养基都能使铁皮石斛种子萌发,并生长成圆锥状原球茎。比较几种培养基的萌发时间和长势可知,只添加马铃薯泥萌发时间长,且原球茎生长较慢,个体偏小,且原球茎诱导出现少量黄绿色。培养基中添加NAA质量浓度为0.1 mg/L时,铁皮石斛种子萌发时间明显缩短,原球茎绿色,随着培养基中添加NAA质量浓度增加,铁皮石斛种子萌发时间变短,且原球茎生长变快,颜色变绿,但当NAA添加质量浓度为0.3 mg/L时,随着培养时间的延长,原球茎部分出现半透明状。因此,1/2MS+10 g/L马铃薯泥+0.2 mg/L NAA更有益于铁皮石斛种子萌发,该培养基中铁皮石斛种子萌发快,颜色深绿,长势旺盛。

2.2 不同浓度激素对铁皮石斛原球茎增殖和分化的影响从表2可以看出,在MS培养基中添加不同浓度的6-BA和NAA均能促进铁皮石斛原球茎增殖和分化。6-BA浓度在1.0～2.0 mg/L,铁皮石斛原球茎增殖和分化系数整体呈上升趋势,培养基添加不同浓度6-BA和NAA组合,铁皮石斛原球茎增殖生长和分化生长有一定区别,6-BA在同一浓度水平时,随着NAA浓度的升高原球茎增殖率增加而分化系数先增加后减少,而且,当6-BA和NAA添加量分别达到2.0和1.0 mg/L时,培养90 d出现部分玻璃化。MS添加2.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA更适合原球茎增殖、分化,原球茎增殖过程中颜色深绿,新生原球茎饱满,分化成苗后苗色浓绿,生长旺盛。

表2 不同浓度激素对铁皮石斛原球茎增殖和分化的影响Table 2 Effects of different concentrations of hormones on the proliferation and differentiation of Dendrobium officinale protocorms

2.3 添加马铃薯泥对铁皮石斛原球茎增殖和分化的影响从表3可以看出,培养基中添加马铃薯泥,铁皮石斛原球茎增殖和分化速度没有明显变化,但是随着马铃薯泥添加量的增加,添加马铃薯泥培养基中原球茎更加膨大,颜色更深,在培养90 d后,分化的幼苗高度略有降低,但幼苗茎粗增加、叶片更大。马铃薯泥在原球茎增殖阶段能够明显增加增殖系数,在分化阶段,虽然添加马铃薯泥后分化系数增加,但是增加系数低于增殖过程中的系数。添加量在80 g/L时,由于马铃薯本身所含淀粉,培养基质地较硬,因此最终选择马铃薯泥添加量为60 g/L。

2.4 铁皮石斛组培苗生根培养从表4可以看出,铁皮石斛幼苗生根马铃薯泥添加量的增加根长先增加后减少,随着NAA浓度增加根数明显增多,结合表4中2种添加物对铁皮石斛壮苗生根的综合影响,1/2MS+1.0 g/L活性炭+0.5 mg/L NAA+40 g/L马铃薯泥幼苗长势最好。

表3 添加马铃薯泥对铁皮石斛原球茎增殖和分化的影响Table 3 Effect of adding mashed potato on the proliferation and differentiation of Dendrobium officinale protocorms

2.5 铁皮石斛驯化移栽炼苗7 d后,铁皮石斛叶色转深,茎秆明显粗壮,根系生长,即可移栽。移栽时选择直径1.0～1.5 cm的松树皮基质,可在表面覆盖苔藓以保湿,移栽后大棚湿度在85%左右直至新叶长出,成活率达到90%以上。

表4 添加物对铁皮石斛壮苗生根的影响Table 4 Effects of additives on the rooting of Dendrobium officinale seedlings

3 讨论与小结

石斛属植物组织培养中常利用的外源激素主要是BA、ZT和KT等细胞分裂素类和NAA、IAA、IBA等生长素类[7],杨立昌等[8]研究表明6-BA浓度在3.0 mg/L时原球茎诱导效果最好,而张雪梅等[9]研究表明6-BA浓度超过1.0 mg/L原球茎生长受到抑制。张华通等[10]研究表明6-BA与NAA对石斛种子的诱导效果不同,6-BA更有利于原球茎的增殖,而NAA对芽苗的生长更有益。现在石斛属植物组织培养过程中有机添加物主要是苹果、香蕉、椰汁、马铃薯、蛋白胨等。俞涵曦等[11]研究表明几种有机添加物中40 g/L马铃薯对串珠石斛原球茎增殖分化的促进效果最好。

该试验以铁皮石斛种子为材料,以马铃薯泥为有机添加物,研究了铁皮石斛种子萌发到原球茎增殖和分化,再到组培苗壮苗生根和炼苗移栽过程中不同培养基激素添加配比的影响。研究结果表明,1/2MS+10 g/L马铃薯泥+0.2 mg/L NAA更有益于铁皮石斛种子萌发,MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+60 g/L马铃薯泥适合铁皮石斛原球茎增殖和分化,原球茎深绿,长势旺盛,分化出的幼苗茎叶深绿,粗壮旺盛。壮苗生根阶段最终选择1/2MS+1.0 g/L活性炭+0.5 mg/L NAA+40 g/L马铃薯泥,铁皮石斛幼苗生长健壮,移栽易成活。