石崖茶水提取物抗氧化活性研究

程忠泉,叶红庆,冯月燕,杨 丹

(1.广州卫生职业技术学院药学院,广东广州 510450;2.广东医科大学药学院,广东东莞 523808)

石崖茶系山茶科(Theaceae)杨桐属(Adinandra)植物亮叶杨桐(AdinandranitidaMerr.ex Li)的干燥叶[1],又名猴茶、石芽茶、石岩茶等,分布于广西、广东、贵州等地,生长于海拔500～1 000 m的沟谷溪边、林缘、林中或石岩边[2]。石崖茶味甘、微苦,性凉,归肝、胆、胃经。石崖茶不含咖啡碱,茶色碧绿,饮后有回甘[3],不影响睡眠[4],具有抗菌、抗肿瘤、护肝明目、消炎、清热解毒、养颜、降血压、健胃消食等作用[5-6],可用于目赤肿痛、目暗干涩、痈疮肿毒、黄疸等[7],在壮、瑶、苗、侗等少数民族地区有着悠久的使用历史[8],常用于治疗咽喉炎、腮腺炎、肥胖症、糖尿病、高血压、高血脂、痢疾等疾病[9-10]。石崖茶含茶碱量低,黄酮含量高,有很高的开发利用价值,荣获“中国名优茶叶”[11]称号。该研究对石崖茶水提取物经大孔树脂用不同浓度乙醇洗脱后各部分的抗氧化活性进行分析,以进一步挖掘该植物的研究与应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试剂。DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、维生素C、1,10-邻菲啰啉、邻苯三酚、Na2HPO4、NaH2PO4、硫酸亚铁铵[FeSO4(NH4)2SO4]、H2O2、铁氰化钠、三氯乙酸、FeCl3、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙醇等,以上试剂均为分析纯。

1.1.2仪器。TU-1901双波长紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;电子分析天平,青岛精诚仪器仪表有限公司;101-3AB型电热鼓风干燥箱,天津市泰斯仪器有限公司;501型超级恒温水浴锅,上海试验仪器有限公司。

1.1.3试材及其处理。石崖茶于2020年6月采自桂林平乐。石崖茶干燥后粉碎,称取100 g,1 000 mL水80 ℃热提2次,每次1 h,合并提取液,放冷后上大孔吸附树脂,分别以0、50%、70%、100%乙醇冲洗,浓缩干燥后得各浓度乙醇冲洗物粉末。

1.2 试验方法

1.2.1DPPH自由基清除率的测定。

1.2.1.1VC对DPPH自由基的清除率。精密称取DPPH粉末0.010 g,用95%乙醇溶解并定容至100 mL,配制成0.1 mg/mL的乙醇样液。取7个10 mL容量瓶,分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的0.1 mg/mL 的VC,然后再分别向7个容量瓶中加入1.0 mL 0.1 mg/mL 的DPPH溶液,摇匀,用95%乙醇定容至刻度。室温下,暗处反应30 min,然后在517 nm波长处迅速测其吸光度,以不加样液溶液为空白,用乙醇溶液参比,计算出VC对DPPH自由基的清除率,公式如下:

(1)

式中:A0为不加样液时的吸光度;A样为加VC的吸光度。

1.2.1.2样品对DPPH自由基的清除率。分别精密称取50%、70%、100%乙醇冲洗的石崖茶大孔树脂洗脱物0.010 0 g样品粉末,用95%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成0.1 mg/mL样品溶液。取7个10 mL容量瓶,分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的0.1 mg/mL的样品溶液,测定吸光度,并计算各洗脱物对DPPH自由基的清除率,计算公式如下:

(2)

式中:A0为不加样液时的吸光度;A样为加DPPH的吸光度;A样0为样品本身的本底值。

1.2.2羟基自由基清除率的测定。

1.2.2.1溶液配制。

(1)溶液Ⅰ。分别取10 mmol/L的FeSO4溶液、10 mmol/L的H2O2溶液、30 mmol/L的水杨酸乙醇溶液各100 mL,依次加至棕色瓶中,振荡摇匀,于37 ℃烘箱中恒温15 min。

(2)溶液Ⅱ。分别取10 mmol/L的FeSO4溶液、蒸馏水、30 mmol/L的水杨酸乙醇溶液各100 mL,依次加至棕色瓶中,振荡摇匀,于37 ℃烘箱中恒温15 min。

(3)VC或样品溶液。精密称取10 mg VC或样品粉末,用95%乙醇溶解并定容至10 mL,配制成1 mg/mL VC或样品溶液。

1.2.2.2VC对羟基自由基的清除率。取6个10 mL容量瓶,先向容量瓶中加入5.0 mL溶液Ⅰ,再依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1 mg/mL的VC溶液,以蒸馏水定容至10 mL,摇匀,然后将6个容量瓶一起置于37 ℃恒温水浴锅中保温30 min,以不加VC溶液为空白溶液,用蒸馏水做参比,在510 nm测定吸光度,并计算出VC对DPPH自由基的清除率,公式如下:

(3)

式中:A0为以蒸馏水代替VC的吸光度;A样为加VC的吸光度。

1.2.2.3样品对羟基自由基的清除率。取6个10 mL容量瓶,分别加入5.0 mL溶液Ⅰ,然后再分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1.0 mg/mL的样品溶液,用蒸馏水定容至刻度;另取6个10 mL容量瓶,分别加入溶液Ⅱ,然后再分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1 mg/mL的样品溶液,用蒸馏水定容至刻度。一起置于37 ℃恒温水浴锅中保温30 min,以蒸馏水做参比,以不加样液为空白溶液,于510 nm处测定吸光度,并计算出各溶液对羟基自由基的清除率,公式如下:

(4)

式中:A0为以蒸馏水代替样液的吸光度;A样为加样液的吸光度;A样0为样液本身的本底值。

1.2.3超氧阴离子自由基清除率的测定。

1.2.3.1VC和样品溶液的配制。精密称取VC或样品粉末0.001 0 g,用乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成0.1 mg/mL VC或样品溶液。

1.2.3.2VC和样品对超氧阴离子自由基的清除率。取7个10 mL容量瓶,分别加入5.0 mL预先于25 ℃恒温水浴锅中预热20 min的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH = 8.0),然后分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的0.1 mg/mL的VC或样品溶液,再分别加入0.5 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液,充分混匀后置于25 ℃恒温烘箱中准确反应5 min,立即加入10 mmol/L浓盐酸终止反应,于420 nm处测定吸光度。以相同体积的蒸馏水代替样液做空白试验,用蒸馏水做参比。VC和样品对超氧阴离子自由基的清除率计算见公式(1)和公式(2)。

1.2.4还原能力的检测。

1.2.4.1溶液配制。精密称取VC或样品粉末0.005 g,用乙醇溶解并定容至10 mL,再从中移取1 mL定容至10 mL,最终配制成0.05 mg/mL VC或样品溶液。

1.2.4.2VC和样品的吸光度。取7个10 mL容量瓶,分别向其加入1.0 mL pH = 6.6的缓冲溶液,再分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL的0.05 mg/mL的VC或样品溶液,然后再分别加入1.0 mL 1%铁氰化钾(淡黄色)溶液,在50 ℃恒温烘箱中反应20 min,冷至室温,再加入1.0 mL 10%三氯乙酸,如有沉淀,混合后以3 000 r/min分离10 min,取上层清液2.0 mL,加入0.5 mL 0.1% 的三氯化铁溶液(普鲁士蓝),混匀,用蒸馏水定容至10 mL,在700 nm处测吸光度。

2 结果与分析

2.1 样品对DPPH自由基的清除率由图1可知,石崖茶各乙醇洗脱物对DPPH自由基的清除率随浓度的增加而增大,且均低于对照品VC。石崖茶70%乙醇洗脱物对DPPH自由基的清除能力最强,浓度在0.006 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率为68.8%;其次是50%乙醇洗脱物,浓度在0.006 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率为42.6%;100%乙醇洗脱物对DPPH自由基的清除能力最弱,浓度在0.006 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率仅为13.6%。

图1 不同乙醇浓度大孔树脂洗脱物对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.2 样品对羟基自由基的清除率由图2可知,石崖茶各乙醇洗脱物对羟基自由基的清除率随浓度的增加而增大,且均低于对照品VC。石崖茶100%乙醇洗脱物有较强的清除能力,但在浓度为0.25 mg/mL时,对羟基自由基的清除率仍仅为34.6%;50%和70%的乙醇洗脱物对羟基自由基的清除率相近,在浓度为0.25 mg/mL时,对羟基自由基的清除率分别为15.2%、18.5%。

图2 不同乙醇浓度大孔树脂洗脱物对羟基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of p-hydroxy radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.3 样品对超氧阴离子自由基的清除率由图3可知,石崖茶各乙醇洗脱物对超氧阴离子自由基的清除率随浓度的增加而增大,且均低于对照品VC。石崖茶50%乙醇洗脱物有较强的清除能力,但在浓度为0.025 mg/mL时,对超氧阴离子自由基的清除率仍仅为48.4%。70%和100%的乙醇洗脱物对超氧阴离子自由基的清除率相近,在浓度为0.025 mg/mL时,对超氧阴离子自由基的清除率分别为27.7%、14.6%。

图3 不同乙醇浓度大孔树脂洗脱物对超氧阴离子自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of superoxide anion radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.4 样品的还原能力由图4可知,石崖茶各乙醇洗脱物还原能力随浓度的增加而增大,且均低于对照品VC。石崖茶70%乙醇洗脱物有较强的还原能力,50%和100%的乙醇洗脱物的还原能力相近。

图4 不同乙醇浓度大孔树脂洗脱物的还原能力Fig.4 Reduction ability of macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

3 结论

该研究对石崖茶水提取物经大孔树脂用不同浓度乙醇洗脱后各部分的抗氧化活性进行了分析,结果发现50%、70%、100%乙醇洗脱物的DPPH自由基的清除率最高值分别为42.6%、68.8%、13.6%,对羟基自由基的清除率最高值分别为15.2%、18.5%、34.6%,对超氧阴离子自由基的清除率最高值分别为48.4%、27.7%、14.6%,以上3种浓度的乙醇洗脱物还原能力均不及VC。70%乙醇洗脱物具有较好的DPPH自由基清除率(68.8%),各洗脱物对羟基自由基、超氧阴离子自由基清除率及还原能力较弱。通过对石崖茶水提取物抗氧化活性的测定,进一步挖掘该植物的研究价值,有助于推动该种植物资源的学术研究及社会价值的挖掘,积极推进民族地方经济发展。