益气活血方对前列腺增殖模型大鼠其作用机理及Bax基因表达的影响

阮 明，肖友平，黄从军，范 凯，娄 强

（贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003）

在中老年男性中经常因为前列腺增生导致排尿功能障碍，其临床症状包括尿频、尿急、排尿不畅，甚至发生尿潴留等，上述这些症状常常对患者的生活质量造成严重的影响，那么如何改善患者的临床症状，提升患者的生活质量，是目前研究的热点之一，α 受体阻滞剂和5α 还原酶抑制剂是治疗前列腺增生的一线用药，但二者皆存在治疗效果有限，且有一定副作用的不足[1]。中药性质温和、靶点广泛、副作用小，而中药复方具有多组分协同、系统调控的特点[2]，已被越来越多的患者所认可及接受，然而其成分复杂，作用机制尚不清楚。本课题的研究旨在通过动物实验的方式，观察益气活血方对前列腺增生模型大鼠前列腺增生组织中Bax 基因表达的影响，探究其治疗良性前列腺增生的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD 大鼠90 只，10～12 周龄，体重在180～220g 之间，由中国人民解放军陆军军医大学提供，许可证号：SCXK-（军）2012-0011，本实验获得贵州中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理批准号：KY2019098，符合中国伦理委员会指导原则。实验开始前先进行适应性喂养1 周。在养殖期间，确保室内温度在22～26℃之间，空气湿度保持在40% ～60% 之间，并提供为期12 小时的光照时间，实验动物可以自由进食和饮水。

1.2 主要药物及试剂

丙 酸 睾 酮 注 射 液（ 规 格1mL、25mg 批 号：100602）由上海通用医药股份有限公司提供；非那雄胺片（规格5mg/ 片批号：II021224）由杭州默沙东制药有限公司提供；益气活血中药颗粒剂由贵州中医药大学第二附属医院颗粒药房提供，中药药物组成（黄芪30g、桃仁20g、桂枝15g、茯苓15g、丹皮15g、川牛膝15g、荔枝核10g、肉桂6g），共126g，每126g 生药制成颗粒剂后重量为10.29g。

1.3 主要实验材料与仪器

HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20180622）、BAX 试剂盒（福州迈新生物科技有限 公 司， 批 号MAB02-54）、OLYMPUS 生 物 显 微镜（北京瑞科中意科技有限公司，DXS1000）、电子分析天平（上海赞维衡器有限公司，ZA120R4）、帆船牌载玻片（北京盛坤海利科技发展有限公司，25.4mm×76.2mm），组织包埋盒、（江苏世泰实验设备有限公司，31050102W）。

1.4 实验方法

（1）分组与造模：前列腺增生模型大鼠的造模方式参照已发表文献[3]，对90 只健康、雄性性成熟的SD 鼠进行随机数字表法分组，其中空白组15 只，实验组75 只，空白组每只大鼠每天用2mL 橄榄油皮下注射，实验组大鼠每天皮下注射丙酸睾酮（5mg/kg，溶2mL 橄榄油），连续给药28 天。

（2）干预方法：造模完成后，采用随机数字表法将实验组的75 只前列腺增生模型大鼠分为模型组、非那雄胺组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组5 个组，其中空白组和模型组大鼠接受的是每天5mL 的生理盐水灌胃，而非那雄胺组实验动物给予8mg/kg 的非那雄胺灌胃每天一次（溶解于5mL 的生理盐水之中）。对中药低、中、高剂量组大鼠分别给予中药0.85g/kg、1.7g/kg、2.55g/kg，使其溶于5mL生理盐水，连服28 天。

（3）观察指标：连续给药28 天后，大鼠禁食24h 后，脱颈处死，重新称重，迅速打开腹腔取出前列腺，将周围多余组织剔除，表面的水分用吸水纸吸干即可，每一组大鼠的前列腺组织进行HE 染色，观察其组织病理形态，利用免疫组化技术，测定每组大鼠前列腺组织内Bax 蛋白的表达程度。

前列腺组织HE 染色：先取前列腺组织的一部分切片，浸泡在蒸馏水中一段时间，再用苏木素水溶液浸染几分钟，最后用酸水和氨水进行颜色分离。将试样水洗1h 后，再放入蒸馏水中浸泡数秒，再用70%和90% 的乙醇各脱水10min，接下来对样品进行酒精伊红染色处理，时间为2～3min，然后再进行渐变乙醇脱水，二甲苯（Dialene）透明处理，将材料周围多余的液体清除，加入适量的中性树胶，盖玻片覆盖，最后在生物显微镜下观察其前列腺组织的病理形态。

免疫组化法检测Bax 蛋白表达：用4% 以上的多聚甲醛溶液固定剩余前列腺组织20h，再经过脱水处理，用石蜡包裹埋藏，最终组织切片，遵照检测试剂盒的说明，在清洗样品的过程中加入抗磷酸盐缓冲液（PBS），再加入二抗体，二氨基联苯胺（DAB）显色，后复染苏木素，二甲苯透明后中性树胶封片，生物显微镜下观察其阳性情况（见图1），Bax 的阳性颗粒通常在前列腺上皮细胞的细胞质中表达，阳性颗粒通常呈黄色或棕黄色。我们采用IMAGE 技术，结合J 图像分析软件，对每组大鼠的Bax 蛋白质进行平均光密度检测。

图1 益气活血中药对模型大鼠前列腺组织病理形态学的影响（HE，×400）

图2 各组前列腺组织中Bax 蛋白的表达情况(×400）

（4）统计方法：本研究所采用的统计方法是利用SPSS23.0 软件进行数据分析，获取有关统计信息。对于测量资料，若符合正态分布，则采用单因素方差分析；如果不符合正态分布，则采用非参数检验分析，P＜0.05 则提示有统计学意义。

2 结果

2.1 益气活血方对前列腺增生模型大鼠前列腺组织病理的影响

由图1 可见，空白组前列腺腺体及细胞排列整齐有序，呈大小一致的单层矮柱状，在显微镜下观察腺腔内未见扩张，腺体内腺上皮细胞向腺腔突出、排列紧密有序、表面光滑、未见明显分泌物。核内核仁呈暗色，着色较深；模型组前列腺腺体紧密聚积，腺腔扩张，腺体上皮细胞向内突出呈乳头状或锯齿状，表现为复层或假复层排列，间质和小血管水肿，同时分泌物增多；中药治疗组光镜可见腺体增生不明显，腺体排列较整齐，小部分腺体细胞腺腔变大，但腺腔基本光滑，腺上皮细胞大多呈单层柱状排列，仅有少量腺上皮细胞突入腔内，间质和血管扩张充血水肿较轻。

2.2 益气活血方对前列腺增殖模型大鼠前列腺Bax 蛋白的影响

模型组Bax 和空白组相比较（P＜0.05），说明本实验成功复制了前列腺增生模型，同时模型组Bax光密度值明显低于空白组，说明在前列腺增生时Bax作为细胞凋亡促进基因很难发挥其作用。非那雄胺组及中药高剂量组其Bax 平均灰度值与模型组相比较（P＜0.05），中药高剂量组与非那雄胺组相比较说明两药效果相当（见表1）。

表1 各实验组前列腺组织中Bax 蛋白的表达水平（± s)

表1 各实验组前列腺组织中Bax 蛋白的表达水平（± s)

注：* 与空白组比较P ＜0.05 ；Δ 与前列腺增生模型组比较P ＜0.05 ：# 与非那雄胺组比较P ＜0.05。

组别 数量（n） 光密度值（IU）空白组 15 0.2113±0.02355前列腺增生模型组 15 0.1115±0.00644*非那雄胺组 15 0.1770±0.00795*Δ中药低剂量组 15 0.1277±0.00444*Δ#中药中剂量组 15 0.1301±0.00802*Δ#中药高剂量组 15 0.1756±0.00846*Δ

3 讨论

前列腺增生属于中医“癃闭”“精癃”范畴，早在2000 年前的《黄帝内经》就有关于“癃闭”的论述，后世医家不断总结，提出“小便不畅，点滴短少，病情较缓者为癃；排尿困难，点滴不通，病情较急者为闭”。中医学指出，癃闭的病因在于肾气亏虚，导致膀胱气化失司，同时还伴随着血瘀、湿热、气滞等病理因素[4-5]。随着现代医学家对该疾病的认知逐渐加深，他们更加强调了“精气夺则虚”的观点，即肾虚血瘀是导致该疾病发生的根本原因。因此，益气利水、活血化瘀是治疗癃闭的基本方法，通过疏通积聚、通畅水道，可以使癃闭的临床症状得到很大的缓解[6]。采用益气活血、清热利湿的疗法，可有效降低前列腺指数，从而促进增生的前列腺萎缩[7]，同时还可以改善患者排尿困难等症状。桂枝茯苓丸出自《金匮要略·妇女妊娠病脉证并治》，起初用来治疗妇女宿有血块、瘀血经闭、月经腹痛、产后恶露不畅等症，能活血、化瘀、消肿。近年来，大量的临床研究表明，桂枝茯苓丸在治疗良性前列腺增生方面具有显著的疗效[8-10]，贵州中医药大学第二附属医院泌尿外科长期从事前列腺增生的研究工作，并在桂枝茯苓丸原方的基础上进行加减，从而形成自己的协定方，命名为“益气活血方”。近年来，细胞凋亡的研究在前列腺增生症的发病过程中逐步深入，Bax 蛋白、Caspase-3 酶和Bcl-2 蛋白在细胞凋亡过程中的不平衡相互作用是一个非常重要的因素[11]，这些因素参与了增殖分化期的调节与控制，而最终导致细胞死亡或坏死。Bax 和Bcl-2 的表达动态平衡对于维持前列腺组织形态的正常，以及在前列腺增生的发生、发展和预后方面扮演着至关重要的角色[12]。在前列腺增生的过程中，Bax基因的表达水平显著降低，这是由于其在促进细胞凋亡方面的作用受到了抑制。在本次实验中，模型组的Bax 表达水平显著低于其他组，这表明Bax 基因在促进前列腺腺体增生时的细胞凋亡作用明显减弱。在正常组织中，Bax 基因的表达量显著高于其他组，这表明只有当Bax 的表达量达到较高水平时，才能维持组织细胞的正常新陈代谢。通过治疗后非那雄胺组、中药高剂量组和模型组相比较，其Bax 表达水平明显升高，说明非那雄胺及益气活血方均能增加Bax 的表达，促进前列腺细胞的凋亡，抑制前列腺腺体增殖，进而对前列腺增生起到治疗作用。

综上所述，本研究以益气活血为法则，遴选出黄芪、桃仁、桂枝等8 味中药对前列腺增生模型大鼠进行治疗，并从组织病理形态，以及对Bax 基因表达等方面进行研究，证实了益气活血中药对前列腺增生具有良好的治疗作用。同时也进一步证实细胞凋亡在前列腺增生的发病过程中起着重要的作用，益气活血法对前列腺增生的治疗是通过调节凋亡抑制基因及凋亡促进基因的表达从而发挥其治疗作用的，为中药治疗前列腺增生提供了新的依据。