咖啡豆乙醇部位的化学成分研究

肜 霖, 王 波, 宋旭艳, 马舒翼, 周小龙, 董爱君*, 杨新洲*

(1.湖北中烟工业有限责任公司技术中心, 武汉 430040; 2.中南民族大学药学院, 武汉 430074)

茜草科咖啡属植物在全世界范围内均有分布,其原产地在非洲中北部,现国内亚热带地区也有广泛种植.咖啡种类约有90多种,以咖啡豆为原料的饮料制品因风味独特而深受人们喜爱.我国最早引进咖啡种植可以追溯到1884年,首棵咖啡树在台湾种植.目前,云南、海南和广东等地是我国重要的咖啡生产区,其在食品和药品领域的应用引起了人们广泛的关注.咖啡豆性平,微苦偏涩;具有提神醒目、利尿促泄、健胃等功效,现多做提神饮品风靡全球[1].咖啡豆含有多种化学成分,包括酚酸类,黄酮类,萜类等,其中以酚酸类含量为多,具有降糖、降脂、抗氧化、保护心肌等作用[2].此外咖啡在热加工食品中可被用作调味剂或促进健康的添加剂,咖啡的化学成分丰富,是影响咖啡生物活性和风味的关键,对其化学成分进行研究对于其在食品药品领域的开发和质量控制具有重要意义.因此本课题综合利用各种分离提取技术对咖啡豆乙醇提取部位中的化学成分进行了分离纯化,最终分离鉴定了15个化合物,其中3个为首次从该植物中分离得到,分别为1,2,4-苯三酚 (11)、5,7-二羟基色原酮 (13)、新绿原酸内酯 (15).

1 实验部分

1.1 仪器和材料

Bruker DRX-600 MHz核磁共振仪(德国Bruker公司),Waters ACQUITY SQD MS液相质谱联用仪,Waters 2535半制备型HPLC仪、Waters 2998 PDA检测器、Waters 2707自动进样器(美国Waters公司),Betasil C18柱 (250 mm × 10 mm, 5 μm, 美国Thermo公司),HP-20大孔树脂(日本三菱公司),GF254薄层硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司),色谱级乙腈(美国TEDIA试剂公司).

1.2 植物来源

咖啡豆产自巴西,样品于2021年8月由湖北中烟工业有限责任公司提供,经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定为咖啡(CoffeaarabicaL.)的种子.

1.3 提取与分离

取500 g咖啡豆,研磨成粉溶于50%甲醇,采用大孔树脂法对浓缩提取液进行粗分,以水-乙醇梯度洗脱(体积比 98∶2→70∶30→50∶50→30∶70→10∶90→0∶100),TLC检测后合并为7个组分,记为Fr. A～Fr. G.Fr. A样品5.02 g,过滤后用高效液相色谱柱(Betasil C18柱,乙腈-水,体积比2∶98→30∶70,流动相含有0.1%的甲酸)拆段共分为11段 (Fr. A-1～Fr. A-11),其中Fr. A-2用半制备HPLC纯化得到化合物10(6.9 mg,tR=17.2 min)、化合物12(2.3 mg,tR=17.5 min);Fr. A-5用半制备HPLC纯化得到化合物11(2.7 mg,tR=25.4 min)、化合物6(6.0 mg,tR=25.6 min);Fr. A-7用半制备HPLC纯化后得到化合物7(8.7 mg,tR=26.4 min)、化合物8(4.0 mg,tR=26.8 min)、化合物9(1.9 mg,tR=27.5 min);Fr. A-8用半制备HPLC纯化得到化合物4(7.5 mg,tR=28.9 min);Fr. A-9用半制备HPLC纯化得到化合物5(8.4 mg,tR=29.8 min).Fr. C样品1.64 g,过滤后用高效液相色谱柱 (Betasil C18柱, 乙腈-水, 体积比2∶98→40∶60, 流动相含有0.1%的甲酸)拆段共分为10段 (Fr. C-1～Fr. C-10),其中Fr. C-4得到化合物1(20.7 mg,tR=23.4 min);Fr. C-8用半制备HPLC纯化后得到化合物2(5.0 mg,tR=29.8 min);Fr. C-10用半制备HPLC纯化后得到化合物3(7.6 mg,tR=30.4 min).同时将Fr. E样品1.0 g直接用高效液相色谱(Betasil C18柱, 乙腈-水, 体积比5∶95→40∶60,流动相含有0.1%的甲酸)分离纯化得到化合物13(5.2 mg,tR=18.1 min),化合物14(4.2 mg,tR=21.5 min)、化合物15(5.4 mg,tR=22.5 min).

图1 化合物 1～15结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-15

2 结构鉴定

综合应用HP-20大孔树脂柱层析、半制备高效液相色谱等多种分离方法对咖啡豆乙醇部位进行分离纯化,运用NMR、MS等现代波谱方法鉴定化学结构,从咖啡豆乙醇部位提取物中分离得到了15个化合物,分别鉴定为咖啡因 (1)、1,4-二-O-(E)-咖啡酰-β-D-吡喃葡萄糖苷 (2)、1,3-O-二咖啡酰甘油 (3)、咖啡酸 (4)、咖啡酸甲酯 (5)、新绿原酸 (6)、绿原酸 (7)、隐绿原酸 (8)、阿魏酸 (9)、烟酸 (10)、1,2,4-苯三酚 (11)、柠檬酸 (12)、5,7-二羟基色原酮 (13)、3,4-二咖啡酰奎宁酸 (14)、新绿原酸内酯 (15).化合物按照结构类型可以分为生物碱、苯丙酸类、酚酸类化合物.

化合物1: C8H10N4O2, 白色晶体, ESI-MS:m/z195 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.85 (1H, s, H-8), 3.96 (3H, s, N7-CH3), 3.51 (3H, s, N3-CH3), 3.32 (3H, s, N1-CH3).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC156.64 (C-2), 153.21 (C-6), 149.81 (C-4), 143.97 (C-8), 108.74 (C-5), 33.93 (N7-CH3), 30.12 (N3-CH3), 28.23 (N1-CH3). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[3],故鉴定该化合物为咖啡因.

化合物2: C24H24O12, 白色非晶态固体, ESI-MS:m/z505 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6):δH7.59 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 7.49 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 7.08 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 7.05 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 7.05 (1H, dd,J=8.1, 2.0 Hz, H-6), 7.02 (1H, dd,J=8.1, 2.0 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,J=8.1 Hz, H-5), 6.77 (1H, d,J=8.1 Hz, H-5′), 6.30 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8), 6.27 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 5.59 (1H, d,J=7.8 Hz, H-1″), 4.03 (1H, t,J=9.6 Hz, H-4″) 3.59 (2H, overlapped, H-3″, H-5″), 3.44 (1H, brd,J=12.0 Hz, H-6″a), 3.35 (2H, overlapped, H-2″, H-6″b).13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6):δC165.99 (C-9′), 165.83 (C-9), 148.46 (C-4), 148.37 (C-4′), 146.67 (C-7), 145.60 (C-3), 145.35 (C-3′), 145.17 (C-7′), 125.51 (C-1′), 125.45 (C-1), 121.46 (C-6), 121.38 (C-6′), 115.77 (C-5), 114.86 (C-5′), 114.74 (C-2), 114.22 (C-2′), 113.97 (C-8′), 113.25 (C-8), 94.11 (C-1″), 75.44 (C-5″), 73.67 (C-3″), 72.74 (C-2″), 70.75 (C-4″), 60.51 (C-6″). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[4],故鉴定该化合物为1,4-二-O-(E)-咖啡酰-β-D-吡喃葡萄糖苷．

化合物3:C21H20O9, 黄色粉末, ESI-MS:m/z417 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.60 (2H, d,J=15.8 Hz, H-7′, 7″), 7.07 (2H, d,J=2.1 Hz, H-2′, 2″), 6.97 (2H, d,J=8.1 Hz, H-5′, 5″), 6.96 (2H, dd,J=8.1, 2.1 Hz, H-6′, 6″), 6.37 (2H, d,J=15.8 Hz, H-8′, 8″), 4.30 (4H, m, H-1,3), 4.17 (1H, m, H-2).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC169.02 (C-9′), 168.50 (C-9″), 149.59 (C-3″), 149.49 (C-3′), 147.15 (C-7′), 146.97 (C-7″), 146.80 (C-4′), 146.79 (C-4″), 127.97 (C-1′), 127.82 (C-1″), 123.03 (C-6′), 123.00 (C-6″), 116.46 (C-5′), 115.72 (C-5″), 115.23 (C-2′), 115.18 (C-2″), 115.10 (C-8′), 115.10 (C-8″), 70.06 (C-1), 70.06 (C-3), 66.40 (C-2). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[5],故鉴定该化合物为1,3-O-二咖啡酰甘油．

化合物4: C9H8O4, 白色晶体, ESI-MS:m/z181 [M + H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.53 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 7.03 (1H, d,J=2.1 Hz, H-2), 6.93 (1H, dd,J=8.2, 2.1 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 6.22 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC171.04 (C-9), 149.47 (C-4), 147.03 (C-7), 146.81 (C-3), 127.78 (C-1), 122.85 (C-6), 116.47 (C-5), 115.51 (C-8), 115.05 (C-2). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[6],故鉴定该化合物为咖啡酸．

化合物5: C10H10O4, 白色晶体, ESI-MS:m/z195 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.54 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8), 7.03 (1H, d,J=2.1 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd,J=8.2, 2.1 Hz, H-6), 6.77 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 6.26 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 3.75 (3H, s, 9-OCH3).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC169.75 (C-9), 149.59 (C-4), 146.94 (C-8), 146.82 (C-3), 127.66 (C-1), 122.93 (C-6), 116.47 (C-5), 115.08 (C-2), 114.80 (C-7), 51.99 (9-OCH3). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[7],故鉴定该化合物为咖啡酸甲酯．

化合物6: C16H18O9, 淡黄绿色粉末, ESI-MS:m/z355 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.59 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 7.04 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.94 (1H, d,J=8.1, 2.0 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,J=8.1 Hz, H-5′), 6.31 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 5.35 (1H, m, H-5), 4.15 (1H, m, H-3), 3.64 (1H, dd,J=8.5, 3.4 Hz, H-4), 2.20 (1H, m, H-2a), 2.14 (2H, m, H-2b, 6a), 1.96 (1H, dd,J=13.5, 9.8 Hz, H-6b).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC178.40 (C-7), 169.04 (C-9′), 149.44 (C-4′), 146.8 (C-3′, 7′), 127.95 (C-1′), 122.89 (C-6′), 116.44 (C-5′), 115.82 (C-8′), 115.07 (C-2′), 75.39 (C-1), 74.75 (C-4), 73.00 (C-3), 68.31 (C-5), 41.47 (C-6), 36.71 (C-2). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[8],故鉴定化合物为新绿原酸．

化合物7: C16H18O9, 淡黄绿色粉末, ESI-MS:m/z355 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.56 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 7.05 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.95 (1H, dd,J=8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5′), 6.26 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 5.33 (1H, m, H-3), 4.16 (1H, m, H-5), 3.73 (1H, dd,J=8.8, 3.1 Hz, H-4), 2.21 (2H, m, H-6), 2.06 (2H, m, H-2).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC177.12 (C-7), 168.65 (C-9′), 149.58 (C-3′), 147.07 (C-7′), 146.80 (C-4′), 127.77 (C-1′), 122.98 (C-6′), 116.45 (C-5′), 115.24 (C-8′), 115.15 (C-2′), 76.17 (C-1), 73.45 (C-3), 71.98 (C-4), 71.30 (C-5), 38.78 (C-6), 38.21 (C-2). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[8],故鉴定该化合物为绿原酸．

化合物8: C16H18O9, 淡黄色粉末, ESI-MS:m/z355 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.64 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 7.07 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.97 (1H, dd,J=8.1, 2.0 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,J=8.1 Hz, H-5′), 6.36 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 4.80 (1H, m, H-4), 4.29 (2H, m, H-3, 5), 2.20 (2H, m, H-6), 2.04 (2H, m, H-2).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC177.34 (C-7), 169.00 (C-9′), 149.58 (C-4′), 147.13 (C-7′), 146.83 (C-3′), 127.85 (C-1′), 122.97 (C-6′), 116.47 (C-5′), 115.35 (C-8′), 115.12 (C-2′), 79.27 (C-1), 76.57 (C-4), 69.63 (C-3), 65.53 (C-5), 42.69 (C-6), 38.44 (C-2). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[9],故鉴定为隐绿原酸．

化合物9: C10H10O4, 白色晶体, ESI-MS:m/z195 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.65 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 7.20 (1H, d,J=1.9 Hz, H-2), 7.07 (1H, dd,J=8.2, 1.9 Hz, H-6), 6.81 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 6.40 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8), 3.90 (3H, s, 3-OCH3).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC168.86 (C-9), 150.48 (C-3), 149.36 (C-4), 146.65 (C-7), 127.97 (C-1), 124.01 (C-6), 116.45 (C-8), 116.19 (C-5), 111.66 (C-2), 56.42 (3-OCH3). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[10],故鉴定该化合物为阿魏酸．

化合物10: C6H5NO2, 白色粉末, ESI-MS:m/z124 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH9.12 (1H, d,J=1.9 Hz, H-2), 8.71 (1H, d,J=4.9 Hz, H-6), 8.40 (1H, dd,J=7.9, 1.9 Hz, H-4), 7.55 (1H, dd,J=7.9, 4.9 Hz, H-5);13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC168.25 (3-COOH), 153.40 (C-2), 151.28 (C-6), 139.17 (C-4), 129.39 (C-3), 125.17 (C-5). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[11],故鉴定该化合物为烟酸．

化合物11: C6H6O3, 淡黄色粉末; ESI-MS:m/z127 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.43 (1H, d,J=1.8 Hz, H-3), 7.41 (1H, dd,J=8.2, 1.8 Hz, H-5), 6.78 (1H, d,J=8.2 Hz, H-6).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC151.11 (C-4), 145.95 (C-2), 123.72 (C-1), 117.72 (C-6), 115.64 (C-3, 5). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[12],故鉴定该化合物为1,2,4-苯三酚．

化合物12: C6H8O7, 无色针晶; ESI-MS:m/z193 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH2.90 (2H, d,J=15.7 Hz, H-2b, 4b), 2.79 (2H, d,J=15.7 Hz, H-2a, 4a).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC177.00 (3-COOH), 173.60 (C-1, 5), 74.16 (C-3), 43.89 (C-2, 4). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[13],故鉴定该化合物为柠檬酸．

化合物13: C9H6O4, 黄色针状结晶; ESI-MS:m/z179 [M+H ]+.1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6):δH12.70 (1H, s, OH), 10.89 (1H, s, OH), 8.18 (1H, d,J=5.9 Hz, H-2), 6.35 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8), 6.27 (1H, d,J=5.9 Hz, H-3), 6.20 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6).13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6):δC181.32 (C-4), 164.38 (C-7), 161.63 (C-5), 157.82 (C-9), 157.50 (C-2), 110.51 (C-3), 104.92 (C-10), 99.02 (C-6), 93.99 (C-8). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[14],故鉴定该化合物为5,7-二羟基色原酮．

化合物14: C25H24O12, 淡黄色粉末; ESI-MS:m/z517 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6):δH7.45 (2H, d,J=15.9 Hz, H-7′, 7″), 7.04 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 7.01 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2″), 6.97 (1H, dd,J=8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.94 (dd,J=8.2, 2.0 Hz, H-6″), 6.74 (2H, d,J=8.2 Hz, H-5′, 5″), 6.25 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 6.17 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8″), 5.43 (1H, m, H-3), 4.95 (1H, dd,J=7.2, 3.2 Hz, H-4), 4.03 (1H, m, H-5), 1.94-2.10 (4H, m, H-2, 6).13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6):δC174.47 (C-7), 165.96 (C-9′), 165.79 (C-9″), 148.45 (C-4′, C-4″), 145.58 (C-7′, C-7″), 145.34 (C-3″, C-3″), 125.50 (C-1′, 1″), 121.44 (C-6′), 121.37 (C-6″),115.86 (C-5′) , 115.75 (C-5″), 114.87 (C-2′, C-2″), 114.19 (C-8′), 113.98 (C-8″), 72.69 (C-1), 68.26 (C-5), 67.23 (C-3), 38.12 (C-2), 37.61 (C-6). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[15],故鉴定该化合物为3,4-二咖啡酰奎宁酸．

化合物15: C16H16O8, 淡黄色粉末, ESI-MS:m/z337 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6): 7.53 (1H, d,J=15.8 Hz, H-7′), 7.03 (1H, brs, H-2′), 7.01 (1H, d,J=8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5′), 6.25 (1H, d,J=15.8 Hz, H-8′), 6.15 (1H, s, 1-OH), 5.69 (1H, s, 4-OH), 4.72 (2H, m, H-3, 5), 4.15 (1H, m, H-4), 2.38 (1H, d,J=11.4 Hz, H-2a), 2.21 (1H, m, H-2b), 2.03 (1H, m, H-6a), 1.94 (1H, t,J=11.7 Hz, H-6b);13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6):δC177.17 (C-7), 165.72 (C-9′), 148.53 (C-4′), 145.62 (C-3′, 7′), 125.49 (C-1′), 121.44 (C-6′), 115.80 (C-5′), 114.81 (C-2′), 113.75 (C-8′), 75.71 (C-3), 71.45 (C-1), 68.53 (C-5), 62.78 (C-4), 36.50 (C-2), 35.63 (C-6). 其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[16],故鉴定该化合物为新绿原酸内酯．

4 结语

运用NMR、MS等现代波谱方法鉴定化合物的化学结构,从咖啡豆乙醇部位提取物中分离鉴定了15个化合物,分别鉴定为咖啡因 (1)、1,4-二-O-(E)-咖啡酰-β-D-吡喃葡萄糖苷 (2)、1,3-O-二咖啡酰甘油 (3)、咖啡酸 (4)、咖啡酸甲酯 (5)、新绿原酸 (6)、绿原酸 (7)、隐绿原酸 (8)、阿魏酸 (9)、烟酸 (10)、1,2,4-苯三酚 (11)、柠檬酸 (12)、5,7-二羟基色原酮 (13)、3,4-二咖啡酰奎宁酸 (14)、新绿原酸内酯 (15).其中有3个化合物为首次从该植物中分离得到,分别为1,2,4-苯三酚 (11)、5,7-二羟基色原酮 (13)、新绿原酸内酯 (15).咖啡豆的化学成分是影响咖啡生物活性和风味的关键,本文对咖啡豆的化学成分进行研究,为进一步完善和推进咖啡相关研究提供了一定的参考依据,这对于其在食品药品领域的开发和质量控制具有重要意义.