岳麓连蕊茶与单体红山茶不同花期及器官香气挥发性成分的分析

杨 敏, 李清源, 向琮琳,4, 陈宝林,傅 劭, 杜克兵, 张冬林, 许 林*

(1. 武汉市农业科学院林业果树研究所, 武汉 430075; 2.华中农业大学园艺林学学院, 武汉 430070;3.佐治亚大学园艺系, 美国 雅典 30602; 4.武汉市江夏区园林和林业局, 武汉 430200)

花香是园林植物的重要观赏性状之一,有香气的山茶属植物花朵极为罕见[1].岳麓连蕊茶(Camelliahandelii)是山茶属连蕊茶组的常绿灌木,原产于广西、湖南、湖北、四川等地[2],为我国特有树种,其花朵密集,具香气,抗逆性强,是山茶属中少有的香花资源之一,具有广阔的应用前景[3].目前山茶属仅有少数香花型种类的香气成分被鉴定,如挥发性成分香气物质以顺式氧化芳樟醇、水杨酸甲酯、十四烷等为主的‘克瑞墨大牡丹’(C.japonicavar.‘Kramer’s supreme’)[4];以苯乙酮、顺式-芳樟醇氧化物和芳樟醇为主的茶梅‘冬星’(C.sasanqua‘Dongxing’)[5]、以芳樟醇、1,8-桉叶素、苯乙醇为香气主体成分的云南核果茶(PyrenariayunnanensisHu)[6]等.尚未见岳麓连蕊茶香气研究报道.

本文以岳麓连蕊茶和单体红山茶(Camelliauraku(Mak.) Kitamura)为研究对象,通过感官评价分析了两种茶花的香气特征及类型,采用顶空固相微萃取技术(head-space solid-phase microextraction, HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)的分析方法对其不同部位在开花过程中的挥发性成分进行了检测.其中固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)用于分析植物组织中的挥发性成分[7],其萃取效果佳、简单、样品摄取量少、低成本,可定量[8];GC-MS 技术则具有较高的灵敏度、分辨率和大量标准谱库,能够分析具有挥发性的小分子代谢物,是目前挥发性成分的主要分析平台之一[9].如今,已应用于多种花果香气的挥发性成分检测中,如玉簪[10]、玫瑰[11]、猕猴桃[12]等.本研究为了解岳麓连蕊茶香气释放机理奠定了基础, 为不同类型的茶花香气形成提供了技术参考,并对进一步克隆香气相关基因、开展茶花芳香转基因育种具有指导意义.

1 材料与方法

1.1 感官评价

采集盛花期的岳麓连蕊茶和单体红山茶的新鲜枝条插在水中,置于(25±1) ℃室内平衡1 h左右,通过30人小组(21女9男)反复嗅闻茶花,选择最符合样品的感官描述词,如花香(floral)、甜香(sweet)、草香(grassy)、果香(fruity)、青香(green)、脂肪香味(fatty)、苦涩香味(bitter)、辛辣味(spicy)、蜡质味(waxy)等[13].另外,采用10分量表对香气强度进行评分:无气味0,弱:1～3,中等:4～6,重度:7～10.在数据处理之前,对一致性和重复性进行评估以剔除异常值,并以平均得分(取整)作为最终结论.

1.2 研究材料及仪器

研究对象为武汉市农业科学院林业果树研究所茶花资源圃种植的8年生岳麓连蕊茶、单体红山茶.气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(美国 Agilent 公司);65 μm PDMS/DVB SPME萃取头及SPME手动进样器,均产自美国Supelco公司;10 μL N型液相进样针(上海Truelab有限公司);玻璃顶空进样瓶;甲醇试剂;内标溶液:癸酸乙酯(纯度99.99%)(德国CNW科技公司).标准品:C9～C40正构烷烃标样(美国Thermo公司).

1.3 GC-MS分析

色谱条件:毛细管柱 HP-5MS,载气为高纯氦气(99.999%),流速为 1.0 mL · min-1,进样口温度 250 ℃;升温程序:起始温度 50 ℃保持 2 min,按 3 ℃·min-1升温至 110 ℃,然后以5 ℃·min-1升温至 220 ℃,保持 2 min.质谱条件:电离源为 EI,其电离能量 70 eV,MS 四级杆温度为 260 ℃,离子阱温度 230 ℃,质量扫描范围 30～500 u.进样方式为分流进样.

选择岳麓连蕊茶和单体红山茶的健壮植株,分别于蕾期、初花期、盛花期、末花期4个开花时期采集花朵样品,其中,盛花期的花朵分为花瓣和雄蕊.称取并记录单花花朵、雄蕊、花瓣鲜样质量,迅速分别装入50 mL顶空进样瓶中,使用10 μL平头微量进样器加入 1 μL(1×10-5体积浓度)的癸酸乙酯内标(以甲醇为溶剂)并密封.

将老化过的萃取头(65 μm PDMS/DVB SPME)插入进样瓶中,室温条件(25±2)℃顶空吸附30 min.随后将萃取头插入GC-MS 进样口解析5 min.为避免杂质残留,首次使用的SMPE萃取头需在GC-MS进样口270 ℃条件下老化30 min.每个样品设置3个生物学重复.

1.3 数据分析

定性分析:根据质谱图数据,使用Xcalibur软件将峰图匹配至NIST标准谱图库,对保留时间、质谱峰图等参数进行分析,结合保留指数对化合物进行定性.根据线性升温公式计算各成分的保留指数(rentention index,RI)[14]:

IR=100Z+100[tR(x)-tR(Z)]/[tR(Z+1)-tR(z)],

式中,Z和Z+1分别表示正构烷烃的碳原子数,x表示待分析的化合物,tR(X)为碳原子处于tR(Z)和tR(Z+1)之间的正构烷烃的色谱峰的保留时间.

定量分析:以癸酸乙酯为内标,利用待测化合物峰面积与内标峰面积之比,进而求得各个挥发性成分的含量.挥发性成分绝对含量计算公式如下:挥发性成分含量(μg · g-1)=(待测物质的峰面积×内标浓度×内标体积)/(内标的峰面积×样品质量).利用Excel和IBM SPSS Statistics 26软件进行数据统计分析,,组间比较采用单因素方差分析.

2 结果与分析

2.1 感官评价

两种茶花的香气强度和香气属性存在明显差异.岳麓连蕊茶被评价为中度的 “草香”、“花香”和“甜香”;而单体红山茶则为较弱的“花香”(表1).这与 GC-MS 的定量结果一致,萜类、醇类的化合物具有较高含量.

表1 茶花感官评价表

2.2 两种茶花不同开花时期及部位的香气变化规律分析

2.2.1 不同开花时期香气变化规律分析 经GC-MS分析,不同挥发性成分在两种茶花不同花期的释放量存在较大差异.由蕾期至末花期,两种茶花的香气释放量均呈先上升后降低的趋势.岳麓连蕊茶蕾期挥发性成分释放量最少,仅为1.25 μg · g-1,于其盛花期到达顶峰49.23 μg · g-1(图1a).相比之下,单体红山茶各个时期的挥发性成分释放量均低于前者,盛花期挥发性成分释放量最高为15.23 μg · g-1,仅约为岳麓连蕊同期挥发性成分释放量的30% .

注:*、**、***、ns分别表示p<0.05,p<0. 01,p<0.001,无显著差异,下图同.图1 两种茶花各花期及部位的挥发性物质释放总量分析Fig.1 Analysis of the total aroma release of two kinds of camellia at each flowering periods and tissues

从岳麓连蕊茶4个采样时期的样品中共检测出挥发性成分50种(表2),而单体红山茶共检测到29种挥发性成分(表3).还可以看出,在两种茶花香气物质均释放量最高的盛花期,挥发性成分均最多,其中岳麓连蕊茶为34种,单体红山茶为19种.

表2 岳麓连蕊茶不同花期和部位的挥发性成分释放量

表3 单体红山茶不同花期和组织的挥发性成分释放量

就盛花期来看,两种茶花中相对含量5% 以上的成分在岳麓连蕊茶中有4种,单体红山茶中6种.其中岳麓连蕊茶中相对含量由高到低依次为苯乙醇(43.97%)、α-罗勒烯(24.8%)、芳樟醇氧化物(呋喃类)(6.94%)、芳樟醇(6.50%);单体红山茶中相对含量由高到低依次为反式芳樟醇氧化物(呋喃类)(33.23%)、顺-3-壬烯-1-醇(16.91%)、苯乙醛(15.1%)、芳樟醇(7.55%)、仲辛酮(6.37%)、四氢-2,2,6-三甲基-6-乙烯基-3-吡喃酮(5.03%).

2.2.2 不同部位的香气变化规律分析 挥发性成分在不同释香部位中的含量存在较大差异.总体上看,岳麓连蕊茶的花瓣和雄蕊中苯乙醇和α-罗勒烯的相对含量均明显高于其它挥发性成分(表2);而单体红山茶中,反式芳樟醇氧化物(呋喃类)和顺-3-壬烯-1-醇均为其主要挥发性成分(表3).两种茶花中,雄蕊的挥发性成分含量均远高于花瓣中的含量(图1b).岳麓连蕊茶花瓣、雄蕊的香气释放量分别为16.06 μg · g-1和42.78 μg · g-1,约为同期单体红山茶香气释放量的6倍(2.73 μg · g-1)和3倍(16.00 μg · g-1).

2.3 两种茶花不同开花时期及部位挥发性成分类别分析

在岳麓连蕊茶与单体红山茶花朵中均检测到7类相同的挥发性成分,包括苯环类/苯丙素类、醛类、萜类、醇类、酮类、烃类和酯类(表4).这些成分的释放量同样是先增加后减少,于盛花期达到最大释放量,表现出与总释放量相似的变化规律.

表4 两种茶花不同花期和释香部位挥发性成分分类

两种茶花释放的挥发性成分的成分、含量差异较大.岳麓连蕊茶花朵的主体挥发性成分以萜类和苯环类化合物为主.在开花的整个过程中,萜类化合物的相对含量均最高,蕾期、初花期、盛花期、末花期中萜类化合物的相对含量分别为68.89%、90.55%、52.32%、89.98%,其中盛花期的绝对含量达到顶峰25.78 μg · g-1.对于单体红山茶各时期的挥发性成分而言,除酯类化合物主要释放于蕾期和初花期,其他化合物均主要释放于盛花期和末花期(以萜类和苯环类化合物为主).

进一步分析两种茶花的花瓣和雄蕊不同类别挥发性成分的含量,结果表明,萜类化合物在岳麓连蕊茶不同部位的含量均为最高, 总释放含量为35.47 μg · g-1,且花瓣和雄蕊释放的萜类化合物的含量存在差异;而单体红山茶的萜类化合物几乎都来源于雄蕊.此外,苯环类/苯丙素类化合物在岳麓连蕊茶中的总释放含量(17.95 μg · g-1)仅次于萜类化合物,单体红山茶以萜类化合物(5.63 μg · g-1)为主,其次为苯环类化合物(4.70 μg · g-1).

3 讨论

植物花香化合物是植物花朵释放的次生代谢产物,由许多低分子量、易挥发的化合物混合而成[15].根据其结构不同可分为萜烯(terpenoids)、苯丙素/苯环类(phenylpropanoids/benzenoids)和脂肪酸(fatty acid)三大类[16].不同植物释放的挥发性成分差异较大,如在腊梅[17]、浓香型百合[18]中,反式β-罗勒烯和芳樟醇为其主要挥发性成分;苯乙醇、香茅醇、橙花醇、香叶醇乙酸酯类化合物在玫瑰花中相对含量较高[19].

本研究中两种茶花的挥发性成分物质,均为萜类化合物占主导地位,与范正琪等[4]对‘克瑞墨大牡丹’的研究结果较为一致.但主体成分与已报道的其它茶花种(品种)不完全相同,如芳樟醇是‘克瑞墨大牡丹’、云南核果茶、茶梅‘冬星’共同的重要挥发性成分[4-6];苯乙酮、芳樟醇及其氧化物为‘冬玫瑰’、‘小玫瑰’、昭和之荣’等多个茶梅品种的主要挥发性成分[20].说明不同茶花之间的挥发性成分也存在巨大差异.本研究中岳麓连蕊茶中的主体成分为苯乙醇(具有花香[21]),α-罗勒烯(具有草香和橙花香[22]),单体红山茶中主体成分为反式芳樟醇氧化物(呋喃类)(具有强烈的甜香和花香[23]).因此,推测α-罗勒烯、反式芳樟醇氧化物(呋喃类)可能分别是岳麓连蕊茶与单体红山茶的致香成分,而岳麓连蕊茶的萜类化合物释放量远远高于单体红山茶,这可能是两种茶花香气嗅觉差异的主要原因.

随着花朵的开放,其释放出的挥发性成分的种类和含量均呈明显变化.本研究中,两种茶花的蕾期至末花期,挥发性成分和释放量均呈现先增加后减少的变化趋势,盛花期的挥发性成分相对含量最高且物质种类最为丰富.这与鼓槌石斛(Dendrobiumchrysotoxum)[24]、东方百合‘西伯利亚’(Lilium‘Siberia’)、亚洲百合‘罗马广场’(Lilium‘Novano’)[25]、文心兰(Oncidiumhybridum)[26]等研究结果较为一致.

梅花(Prunusmumi)[27]的主要香气化合物乙酸苯甲酯在花瓣和雄蕊中均有释放,但主要来源于后者;芍药‘巧玲’(Paeonialactiflora‘Qiao ling’)[28]在瓣化雄蕊中香气物质释放量最高,外层花瓣次之,而雌蕊与萼片中较少,其主要挥发性成分芳樟醇与苯乙醇主要分布在花瓣与瓣化雄蕊中.王洁等[29]认为内轮花瓣和雄蕊是茶梅‘冬玫瑰’香气释放的主要部位.表明花瓣与雄蕊均对花香的释放有着同样重要的贡献.也有一些花朵的主要挥发性成分释放于除花瓣和雄蕊以外的花器官.如玉兰‘飞黄’(Magnoliadenudata‘Feihuaug’)不同轮次花被片中,内轮花被片挥发性成分总量最高[30];杂交兰[31]花器官不同部位中, 花瓣和萼片主要释放β-石竹烯,唇瓣主要释放β-罗勒烯.本研究中,岳麓连蕊茶的花瓣和雄蕊均释放出大量的挥发性成分且相对含量差异不大,而单体红山茶的雄蕊释放了主要的挥发性成分,这与Jullien等[32]对六种茶花的挥发性成分研究结果较为一致,即雄蕊积累的挥发性成分远高于花瓣.有报道称植物的香气通常是由花器官的基本薄壁组织或特化的腺状表皮细胞[33]中产生,花器官中花香的释放取决化学成分合成区域膜结构上的某些载体对其选择性的释放特性[34].本研究中岳麓连蕊茶是否因雄蕊和花瓣均含有的产生香气的细胞结构而有异于单体红山茶,还有待进一步深入研究分析.

4 结论

本研究以有香茶花岳麓连蕊茶和无香茶花单体红山茶为试材,运用固相微萃取和气质色谱-质谱联用技术对其不同开花时期(蕾期、初花期、盛花期、末花期)和部位(花瓣、雄蕊)挥发性成分和相对含量进行了测定.在岳麓连蕊茶与单体红山茶的开花的四个时期分别共计检测到50、29种挥发性成分.挥发性成分的释放量随花朵的开放,呈先上升后下降的趋势.岳麓连蕊茶的花瓣和雄蕊均为其重要的释香器官,而单体红山茶的雄蕊释放了主要的挥发性成分.两种茶花的挥发性成分均可分为苯环类/苯丙素类、醛类、萜类、醇类、酮类、烃类和酯类这7类化合物.结合感官评价和定量分析,推测苯乙醇和α-罗勒烯可能为岳麓连蕊茶的致香成分;反式芳樟醇氧化物(呋喃类)可能为岳麓连蕊茶的致香成分.