川乌配伍地榆的毒性研究*

马彬焰,陈桃香,何席呈,胡家震,唐 娟,熊厚溪,胡成刚▲

(1贵州中医药大学,贵州 贵阳 550025;2.毕节医学高等专科学校,贵州 毕节 551700)

近年来苗族医药得到较好的发展,苗族医与药紧密相连,苗医治病奇效,苗药起到关键因素,风湿类疾病是苗医治疗的优势病种,其治疗所用药物大部分都具有毒与效双重特性,这也导致安全用药有一定的风险[1-3]。

在贵州省黔东南州调研过程中,发现苗医长期使用乌头(AconitumcarmichaeliiDebx.)治疗风湿病、跌打损伤疼痛等疾病,同时药方常配伍加入地榆,达到减毒存效的作用[4]。在临床中的应用,乌头类药材通常采用加工炮制品或与其他中药(甘草、白芍、干姜等)配伍使用,保持良好疗效的同时又能够降低毒性,保证用药安全。调查发现苗医以川乌配伍地榆使用,且安全有效;经查阅国内外文献,未见关于川乌与地榆配伍的相关报道。在前期工作的基础上,本实验以动物毒性实验来研究川乌及其与地榆配伍的毒性作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级昆明小鼠,体重18～22 g,204只,8周龄内,雌雄各半(厂家:长沙市天勤生物技术有限公司,许可证号:SCXK(湘)2019-0014)。

1.2 药材

川乌药材采集于2021年5月,采自云南省丽江市,经贵州中医药大学中药鉴定教研室吴之坤教授鉴定为川乌(AconitumcarmichaeliiDebx.)的根。

取川乌粗颗粒1 kg,采用渗漉法,以75%乙醇作为渗漉溶剂,渗漉一周,收集渗漉液,合并滤液,45 ℃旋蒸浓缩滤液至一定体积(约1600 mL),将所有药液分装于自封袋中,水平摆放于-60 ℃低温冰箱内,2天后取出,立即放入真空干燥机冷冻干燥,最后得到川乌酒泡液199.5 g冻干粉,得膏率为20%。

取地榆粗颗粒3 kg,加入5倍体积量蒸馏水,回流提取2次,每次15 min,过滤,合并滤液,浓缩至一定体积(约2000 mL),将所得滤液装于自封袋中,水平放置在-60 ℃的低温冰箱中,2天后取出,放入真空干燥机冷冻干燥,得到地榆水煎液300.7 g冻干粉,得膏率为30%。

分别将提取冻干粉于干燥器中保存,临用时配成不同的剂量组。

1.3 仪器与试剂

转轮式切片机(徕卡-2016,德国),JT-12S自动组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司),BMJ-A型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂),RS36型全自动染色机(常州派斯杰医疗设备有限公司),PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司),数字切片扫描仪(Pannoramic 250,3DHISTECH(Hungary))。10%中性甲醛固定液(LL-A1-02,成都里来生物科技有限公司),无水乙醇(GB678-90成都海兴化工试剂厂),米酒(实验室自酿38% Vol.),磷酸氢二钠,甲醛,二甲苯,苏木素染液(CR2102133,武汉塞维尔生物科技有限公司),伊红染液(CR2101094,武汉塞维尔生物科技有限公司),中性树胶(70050050,Biosharp生物公司)等。

2 方法[5-7]

2.1 剂量设置

取小鼠,雌雄各半,根据分层随机法,随机分成11组,采用阶梯法来进行实验。即空白组(10只),川乌给药组:1.5 g/kg、1 g/kg、0.75 g/kg、0.5 g/kg、0.25 g/kg 5个剂量,川乌配伍地榆(1∶2)给药组:2 g/kg、1.5 g/kg、1 g/kg、0.75 g/kg、0.5 g/kg 5个剂量,每组(16～18只)。正常对照灌胃等量米酒。

2.2 急性毒性实验

将小鼠饲养观察一周,适应环境。动物预试验下测得引起(0%)实验动物死亡及(100%)实验动物死亡的剂量。给药前12 h动物禁食不禁水,结合预试验的结果,按照20 mL/kg剂量对小鼠灌胃给药,于给药后的30 min内详细观察并记录小鼠出现的毒性反应,在给药后的4 h和24 h内观察并记录小鼠出现的毒性反应、死亡状况和死亡时间分布,对已死亡动物进行解剖。采用目测概率单位法计算各给药剂量组小鼠的LD50值。

3 结果

3.1 中毒表现

空白组灌胃后,出现晕转、站不稳、麻木等现象,30 min后开始缓解,24 h后全部恢复正常。给药组在30 min内,小鼠出现干呕、颤抖、抽搐、喘息、呕吐、口吐白沫、流涎、呼吸急促、运动减少、昏睡、僵住、肤白体凉、尿失禁、便稀、毛发凌乱等中毒表现。立即解剖死亡动物,发现因呼吸系统衰蝎死亡,可见大量药液残留在胃中,少许药液残留于肠内,部分肝脏颜色偏暗,其他脏器未见异常。

3.2 小鼠的LD50值

观察4 h、24 h内,各给药组小鼠死亡情况,结果如表1-表5及图1-图2所示。

图1 川乌配伍地榆前后4 h内小鼠死亡率对比曲线图

图2 川乌配伍地榆前后24 h内小鼠死亡率对比曲线图

表1 川乌给药组4 h内小鼠死亡结果

表2 川乌给药组24 h内小鼠死亡结果

表3 川乌配地榆(1∶2)给药组4 h内小鼠死亡结果

表4 川乌配地榆(1∶2)给药组24 h内小鼠死亡结果

表5 川乌样品4 h和24 h内LD50值得比较

回归方程为:Y=3.1362X+5.7994(r=0.985),其中,Y为概率单位加5后的值,X为剂量的对数LogX;a=0.01时,查表得r为0.9590,所以LD50=0.5561 g/kg,置信系数a=0.05时,95%的置信区间为:0.4529～0.6827 g/kg。

回归方程为:Y=3.0519X+5.8730(r=0.9631),其中,Y为概率单位加5后的值,X为剂量的对数LogX;a=0.01时,查表得r为0.9590,所以LD50=0.5175 g/kg,置信系数a=0.05时,95%的置信区间为:0.3672～0.7294 g/kg。

回归方程为:Y=3.5293X+4.6142(r=0.9537),其中,Y为概率单位加5后的值,X为剂量的对数LogX;a=0.01时,查表得r为0.9590,所以LD50=1.2863 g/kg,置信系数a=0.05时,95%的置信区间为:0.9398～1.7605 g/kg。

回归方程为:Y=4.6532X+5.0066(r=0.9684),其中,Y为概率单位加5后的值,X为剂量的对数LogX;a=0.01时,查表得r为0.9590,所以LD50=0.9967 g/kg,置信系数a=0.05时,95%的置信区间为:0.7897～1.2581 g/kg。

4 小结与讨论

4.1 小结

以有毒苗药川乌为研究对象,以降低毒性研究为主线,对川乌生品及其与地榆配伍进行急性毒性研究,结果表明:川乌配伍地榆后的毒性明显低于川乌的毒性。川乌配伍地榆药液在4 h和24 h内的LD50值分别为1.2863 g/kg、0.9967 g/kg,置信区间分别为0.9398～1.7605 g/kg和0.7897～1.2581 g/kg;生川乌药液在4 h和24 h内的LD50值分别为0.5561 g/kg、0.5175 g/kg,95%的置信区间分别为0.4529～0.6827 g/kg和0.3672～0.7294 g/kg。

4.2 讨论

在川乌剂量(1.5 g/kg)相同的条件下,川乌及其与地榆配伍给药时间在4 h内,川乌配伍地榆后动物死亡率低于单味川乌小鼠累计死亡率,表明给药4 h内可以看出配伍地榆后毒性有所降低;当川乌及其与地榆配伍给药时间在24 h后,单味川乌给药剂量为1.5 g/kg,川乌配伍地榆给药剂量为1.5 g/kg和2.0 g/kg(以川乌剂量计算)时,3组给药组的小鼠累计死亡率一致。综上可知川乌及其与地榆配伍给药造成动物死亡的0%～100%剂量范围为0.5～1.5 g/kg。

在本实验过程中,由于川乌毒性较大,动物存在个体差异,药物在动物体内的吸收和释放有一定的差异性,从而造成动物中毒死亡情况为两种:一是一次灌胃给药4～24 h内,小鼠累计死亡数接近整组动物数的一半;二是一次灌胃给药24～72 h内,小鼠累计死亡数几乎接近于零;为更好观察川乌及其与地榆配伍后的毒性大小,选择了给药4 h和24 h时间段来确定LD50值。

本实验通过对有毒药材川乌生品及其与地榆配伍的毒性变化分析,探究配伍对有毒药材川乌毒性的影响,为后续其药效学及其配伍减毒作用机制的研究提供了参考依据,同时也为临床安全有效用药提供一定的理论基础和实验依据。