大麦苗酸奶的抗氧化能力与风味特征研究

鲍文娜，赵晨浩，廖鸿秀，陈怡，张子烨，肖功年，李惠,2，潘海峰

（1.浙江科技学院,杭州 310023；2.浙江省市场局乳及乳制品监管技术重点实验室,杭州 310006；3.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,杭州 310023；4.湖州学院，浙江湖州 313000）

0 引言

大麦苗是大麦（Hordeum vulagre L.）的幼苗，一般指大麦抽穗前的幼嫩茎叶，尤其是株高在5～15 cm 的大麦苗营养最佳。它富含蛋白质和赖氨酸等氨基酸[1]，且为碱性食物之王，其碱性是理想碱性蔬菜菠菜的2倍[2]，大麦苗中有多种抗氧化酶，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶，具有清除自由基，分解体内毒素，抗衰老等功效[3]。此外还有多种消化酶[4]，丰富的叶绿素[5]，具有抗疲劳、降血压、抗氧化、抗衰老、消食、护肝、降血糖、通便等功能。

目前，国内外关于大麦苗和酸奶单独的营养价值和生理功效的研究较多，但将大麦苗和酸奶共发酵的功能型酸奶报道较少，且已有研究主要集中在大麦苗酸奶制备条件优化上[6-7]，还未对其活性功能和风味特征进行研究。活性物质的稳定性受氧、温度、pH 等环境因素以及食品体系中蛋白、脂肪等营养成分影响，而食品中这类物质在贮藏期间能否稳定，必然会影响其最终的生物利用率和体内生理活性的发挥。

本研究以具有良好抗氧化功能的大麦苗为对象，将其与酸奶进行共发酵，监测发酵过程中功能因子的变化，模拟胃肠道环境，结合风味物质监测，为开发酸鲜可口、营养丰富、香味浓郁并具有良好保健功能的麦苗酸奶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全脂奶粉，新西兰恒天然有限公司；大麦苗粉，海通食品集团余姚有限公司；乳酸菌种YO-MIX 187（嗜热链球菌与德式乳杆菌保加利亚乳杆菌种混合），丹麦丹尼斯克；过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒(可见光法) 和总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（羟胺法），南京建成生物工程研究所；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和牛胆盐，sigma；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 大麦苗酸奶的制备

大麦苗酸奶的制备参考赵延胜[7]的方法，烧杯中加入700 mL 去离子水，加热至50 ℃，称取100 g（12.5%）全脂奶粉、48 g（6 %）白糖、0.56 g（0.07 %）琼脂、8 g（1 %）淀粉、0.8 g（0.1 %）果胶、3.6 g（0.45 %）大麦苗粉，搅拌均匀。均质1 min，静置30 min，95 ℃水浴杀菌5 min。温度冷却至42 ℃后加入0.01 %发酵剂，100 mL/瓶分装至预先灭菌的玻璃罐中42 ℃发酵6 h。放入4 ℃冰箱内后熟12 h，并于4 ℃冰箱保存，同时设置不添加大麦苗粉的空白对照组。

1.3 活菌数和酸度测定

乳酸菌活菌数测定采用乳酸细菌(MRS)固体培养基倾注法，37 ℃培养48 h，计算菌落总数；滴定酸度根据GB 5009.239—2016《食品酸度的滴定》中酚酞指示剂法测定[8]。

1.4 抗氧化活性测定

总黄酮含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法，以芦丁当量表示（mg/100 g 提取样）[9]；总酚含量测定采用Folin Ciocaolteus 法，以没食子酸当量表示（mg/100 g 提取量）[10]；超氧化物歧化酶SOD 活力和过氧化氢酶CAT 活力采用南京建成SOD 试剂盒检测；总抗氧化活力测定参照许尨[11]方法，以维生素C 当量表示（mg/100 g）；ABTS、DPPH、O2-、OH-、H2O2自由基清除能力的测定分别采用对应的方法[12-14]，并计算IC50值。

1.5 体外消化实验

取10 g 贮藏1 d 的酸奶于50 mL 离心管中，用10 mL 生理盐水稀释，调整pH 并进行模拟口腔（1 min）、胃（1 h）和肠（2 h）的消化[15]。各样品消化前后，提取和测定黄酮含量、多酚含量和总抗氧化活性。

1.6 风味特征研究

采用SPME-GC-MS 进行挥发性风味物质的测定[16]，气质联用仪为美国Agilent 5975C-7890A；毛细管柱HP-5（30 cm×0.25 mm,0.25 μm）；SUPELCO 萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS），并对其进行定性RI 值和定量Ci值的计算，采用ROAV 法评价关键挥发性风味物质[17]。通过电子舌监测酸奶发酵过程中味觉特征的变化。

1.7 数据处理

各实验重复3 次，用Origin 软件作图，SPSS 软件进行差异显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 自由基清除能力分析

大麦苗有较好的抗氧化功能，大麦苗与酸奶共发酵后，监测其在不同浓度下对ABTS、DPPH、O2-、OH-和H2O2自由基的清除率如图1，自由基清除率达50%所对应的酸奶浓度（IC50）如表1 所示。大麦苗酸奶对ABTS、DPPH 和O2-自由基的清除率要显著高于对照酸奶，其IC50值较对照组分别降低26.5%、50.1%和62.4%，但对OH-和H2O2自由基的清除并不明显。

2.2 贮藏期间各物质含量变化

为了考察贮藏时间对酸奶中活性物质含量的影响，酸奶于4 ℃条件下贮存，监测4 ℃条件下贮藏1～21 d 的酸奶中活菌数、滴定酸度、总黄酮、总酚、抗氧化能力，自由基清除能力等的变化如图2。大麦苗酸奶的初始活菌数为29.36×108CFU/mL，是对照酸奶活菌数的1.8 倍见图2（a）。随着贮藏时间的延长，大麦苗酸奶和对照酸奶的活菌数均逐渐下降，但对照酸奶的活菌数下降幅度（21 d 下降61.5%）是大麦苗酸奶（21 d下降14.3%）的4 倍以上，且21 d 后大麦苗酸奶的活菌数量为对照组的4 倍。以上说明大麦苗与酸奶共发酵可以增加乳酸菌数量，并且显著减缓其在贮藏期间活菌数下降幅度。无论是对照酸奶还是大麦苗酸奶，滴定酸度持续上升，且大麦苗酸奶的滴定酸度整体要比对照组高，这可能是因为大麦苗酸奶中含的乳酸菌数量较多导致的。21 d 贮藏后，大麦苗酸奶的滴定酸度为（124±5.6）°T，仍在消费者可接受范围内。

图2 贮藏时间对酸奶活菌数、滴定酸度、总黄酮含量、总酚含量、SOD 酶活性、CAT 酶活性、总抗氧化活力、DPPH 自由基清除率和ABTS 自由基清除率的影响

图3 体外消化对总黄酮含量、总酚含量和总抗氧化活力的影响

图2（c）和（d）显示，大麦苗酸奶的总黄酮含量在0～5 d 及10～15 d 显著下降（P＜0.05），到第21 天时含量比第1 天降低了25.9%。总酚含量在1～10 d 呈下降趋势，10～21 d 则保持相对稳定，到21 d 贮藏期结束时，较初期水平降低了18.5%。对照酸奶的总黄酮和总酚含量在5～10 d 有所降低并在后期保持稳定。从实验结果看，整个贮藏期内，大麦苗酸奶的总黄酮和总酚含量都显著高于对照酸奶。

图2（e）和（f）显示，大麦苗酸奶的SOD 酶活在贮藏中活性一直在下降，到21 d 贮藏期结束时，较初期水平降低30%。对照酸奶几乎无SOD 酶活性。CAT 酶活在1～5 d 活性维持不变，5～10 d 明显降低，后期活性降低幅度减缓，结束时较初期水平降低17.6%。对照酸奶中CAT 酶活性较低，且较初期降低33.3%。图2（g）显示，大麦苗酸奶的总抗氧化活力在前期的1～10 d 呈下降趋势，之后较为稳定，贮藏期降幅为14%。对照组在贮藏期间保持稳定，降幅不显著。

酸奶为30 mg/mL 时，大麦苗酸奶的DPPH 和ABTS 自由基清除率在1～10 d 下降明显，后期较为稳定，贮藏期降幅分别为14.9%和8.8%如图2（h）和（i）。然而对照组DPPH 自由基清除率基本维持稳定，ABTS 自由基清除率下降缓慢。

大麦嫩苗为“碱性食品之王”，可以中和酸性毒素、平衡酸碱，故可能提高乳酸菌对酸的耐受性，从而增加活菌数量。各种活性成分分析发现，大麦苗酸奶具有很好的抗氧化活性，其总黄酮、总酚、SOD 活性、CAT 活性和总抗氧化活性分别是对照组的3.2 倍、2.2倍、17.4 倍、4.3 倍和2.6 倍，并且对DPPH 和ABTS 自由基的清除能力显著高于对照组。

酸奶中黄酮、多酚、抗氧化酶类物质在贮藏期间的稳定性直接影响产品感官品质，同时也对其生物活性和生理功能造成影响。贮藏期活性成分动态监测结果显示，酸奶体系降低了总黄酮、总酚、SOD 酶、CAT酶的贮存稳定性，特别是在1～10 d 下降的最为明显，导致其总抗氧化活性和各种自由基清除效率的下降，但贮藏21 d 后大麦苗酸奶的各种活性物质和抗氧化活性还是显著高于对照组。这与文献报道的结果一致[18]，贮藏期活性物质稳定性降低的原因可能有如下5 方面：①乳酸菌的分解代谢作用加剧了黄酮、多酚类物质的降解和转化[19]；②酸奶中蛋白不断水解使产品质构发生变化[20]，从而影响了黄酮和多酚类物质的提取；③酸奶在加工过程中，热杀菌和发酵时的pH变化使乳中蛋白发生变性，隐藏在分子内部的疏水性基团暴露，促进疏水相互作用及氢键的形成[21]，促使酸奶中多酚和黄酮类物质与乳球蛋白和酪蛋白发生络合反应形成沉淀，从而使游离态的多酚和黄酮类物质转化为结合态，进而影响了黄酮和多酚类物质的提取；④SOD 酶和CAT 酶自身稳定性的原因；⑤酸奶体系中酸性环境与麦苗本身碱性特质的冲突。

2.3 体外消化前后的抗氧化分析

将大麦苗酸奶和对照组酸奶进行口腔液（1 min）、胃液（1 h）和肠液（2 h）消化，监测消化前后总黄酮含量、总酚含量和总抗氧化活性变化。模拟口腔消化对大麦苗酸奶和对照组的总黄酮、总酚和总抗氧化活力均无显著变化，说明口腔液对3 种物质影响不大。胃液消化后可提高总黄酮（大麦苗酸奶提高66.8%，对照组提高2.5%）、总酚（大麦苗酸奶提高196%，对照组提高396%）和总抗氧化活力（大麦苗酸奶提高79.5%，对照组提高113.8%），说明胃液消化能促进3 类成分的释放，可能是胃蛋白酶和胃酸有利于它们从蛋白、果胶等的交联作用中释放，这与已报道的结果相符合[22]。肠液消化后，大麦苗酸奶的总黄酮含量和总抗氧化活力有所下降，但总酚含量维持稳定，保持在较高水平，较初始含量提高了438%。肠液消化后，对照组总黄酮含量维持稳定，总酚含量稍有提高，总抗氧化活力稍有下降。大麦苗中多酚在肠液发生了部分降解，而酸奶中乳蛋白在胰蛋白酶作用下水解释放了水溶性蛋白，从而掩盖了大麦苗多酚的损失，因此才导致对照酸奶总酚含量继续升高，而大麦苗酸奶中总酚含量继续维持较高水平。综上，抗氧化活性物质主要在胃液消化阶段释放，经体外消化后，大麦苗酸奶的总黄酮含量、总酚含量、总抗氧化活力分别比对照组提高315.7%、20.4%、100.8%。

2.4 大麦苗酸奶的挥发性风味物质检测分析

通过对比发酵乳挥发性风味物质成分总离子流图谱，大麦苗酸奶和对照酸奶的挥发性成分较相似。经NIST 11 标准库检索，除去萃取头带来的少量硅氧烷类杂质峰和3 组平行样品中仅个别检测到的峰，利用面积归一化法计算各组分相对峰面积百分比，按照酸类、酮类、醛类、醇类、酯类、其它化合物的方式进行分类。共检测出72 种挥发性物质，其中大麦苗酸奶检测出53 种挥发性物质，对照组检测出47 种挥发性物质。从图4 可以看出，大麦苗酸奶的酸类和酯类化合物数量低于对照组，尤其是酸类化合物，这可能跟大麦苗粉自身的碱性特质相关。大麦苗酸奶中醛类、醇类及芳香烷烃等其它类化合物的数量高于对照组，而酮类物质的数量两者相同。2H-吡喃-2-酮，6-己基四氢、2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-甲醛、十五碳烯醛、戊醇、3-戊基--（2Z）2,4-戊二烯-1-醇、反式-3-甲基-4-辛醇、Z-10-戊烯-1-醇、甲基环庚醇、顺-4-羟基-3-甲基癸酸内酯、邻苯二甲酸，十六-3-基异丁基酯、庚酸2-乙酰氧基甲酯等只在麦苗酸奶中检出。丁酸、十一酸、二氢-2-甲基-3（2H）-噻吩酮、己醇、1 -氨基-2 -丁醇、1,2-苯二甲酸，双（2-甲基丙基）酯、癸酸癸酯、苯甲基酯等只在对照组中检出。

图4 酸乳中各类挥发性物质数量

2.5 关键性风味物质的鉴定

发酵乳的风味是由各挥发性物质的阈值与其在风味体系中的浓度共同决定的，为进一步确定发酵乳的关键性风味物质。结合共有组分的相对含量和感觉阈值，分别确定各样品组分的ROAV。如表2 显所示，对照酸奶中共有6 种挥发性物质的ROAV 大于1，分别是乙醛、乙偶姻、2-壬酮、双乙酰、2-庚酮和1-庚醇，这些物质是混合菌种发酵对照酸奶样品的关键挥发性物质。共有5 种风味物质（0.1≤ROAV＜1）对混合菌种发酵的对照酸奶样品总体香气具有重要修饰作用，分别是辛酸、丁酸、己酸、1-己醇和1-壬醇。乙醛赋予发酵乳清爽的芳香味；乙偶姻赋予发酵乳奶香气、微甜和乳脂气息[23]；2-壬酮赋予发酵乳果香、清香及奶油的气息[24]；双乙酰赋予发酵乳奶油香味[25]；2-庚酮有类似梨的水果香味；1-庚醇有油脂气息和辛辣香气，近似柑橘的香气；辛酸在低浓度时呈水果香气，但稍高浓度略有不舒适的气味；丁酸有难闻的酸臭味；己酸带有类似羊的气味；1-己醇具有椰子和浆果类的香味；1-壬醇有类似于香茅油气味。

表2 酸奶的关键性风味性物质及其对应的ROAV

大麦苗酸奶中共有6 种挥发性物质的ROAV 大于1，分别是双乙酰、乙偶姻、2-壬酮、2-庚酮、1-庚醇和甲基环庚醇，这些物质是混合菌种发酵大麦苗酸奶样品的关键挥发性物质。共有5 种风味物质（0.1≤ROAV＜1）对大麦苗酸奶样品总体香气具有重要修饰作用，分别是乙醛、2-十一烷酮、1-壬醇、辛酸、δ-十二内酯和Z-10-戊烯-1-醇。大麦苗酸奶中乙醛的含量大量降低，双乙酰是最主要的风味物质。甲基环庚醇和Z-10-戊烯-1-醇是大麦苗酸奶中特有的香气物质，加上δ-十二内酯（具有椰子果实的香气）影响，大麦苗酸奶在风味特征上比对照组有了明显的变化。

2.6 电子舌对酸奶的滋味分析

图5 为酸奶样品的电子舌雷达图。大麦苗酸奶和对照酸奶在酸味、甜味、涩味、鲜味、丰富度和苦味回味的传感器中口感差异不明显。咸味上稍有差别，大麦苗酸奶咸味略大于对照酸奶。

图5 酸奶样品的电子舌雷达

通过电子舌监测酸奶在贮藏期间味觉特征的变化情况如图6。大麦苗酸奶和对照酸奶在4 ℃贮藏期间，其咸味、鲜味和涩味变化均不明显。但两者的酸味随着贮藏时间的延长而增加，并且大麦苗酸奶较对照组酸味增加明显，这与滴定酸度结果一致，说明电子舌能够比较真实的反应酸奶的酸味滋味情况[26]。此外，甜味随着贮藏时间的延长而降低，可能是由于在贮藏期间，乳酸菌还在消耗蔗糖以维持其活性[27]。

图6 大麦苗酸奶和对照酸奶贮藏期的动态电子舌雷达

3 结论

本文分析大麦苗与酸奶共发酵及贮存期间，抗氧化活性和风味特征的变化结果显示，大麦苗酸奶的总黄酮含量（25.9±0.5）mg/100 g、总酚含量（13.0±0.6）mg/100 g、SOD 酶活力（62.6±1.5）U/100 g、CAT 酶活力（5.1±0.2）U/100 g、总抗氧化活力（46.3 ±2.1）mg/100 g，活菌数29.3×108CFU/mL，分别为非添加对照酸奶的3.2 倍、2.2 倍、17.4 倍、4.3 倍、2.6 倍、1.8倍，DPPH、ABTS 和O2-自由基清除能力显著增加。贮藏期活性成分动态监测结果表明，大麦苗酸奶的总黄酮总酚含量、SOD 和CAT 酶活力在1～10 d 下降最为明显，导致其总抗氧化活性和各种自由基清除效率下降，但贮藏21 d 后大麦苗酸奶的各种活性物质和抗氧化活性还是显著高于对照组，且贮藏期活菌数下降减缓（大麦苗酸奶下降14.3%，对照组下降61.5%），4 ℃贮藏21 d 后，活菌数为对照组的4 倍。体外模拟消化结果显示，抗氧化活性物质主要在胃消化阶段释放，且经体外消化后大麦苗酸奶的总黄酮含量、总酚含量、总抗氧化活力分别比对照组高315.7%、20.4%、100.8%。SPME-GC-MS 共鉴定出71 种挥发性风味物质，与对照组相比，大麦苗酸奶的风味物质组成、各组分相对含量及关键性风味物质都有显著差异，双乙酰、乙偶姻、2-壬酮、2-庚酮、1-庚醇和甲基环庚醇是表征大麦苗酸奶的关键性风味物质。电子舌分析显示大麦苗酸奶与对照组在酸味、甜味、涩味、鲜味、丰富度和苦味回味的口感差异不明显，咸味上稍有差别，并且随贮藏时间延长，均表现出酸味增加甜味降低的趋势。