水中粪大肠菌群检测方法研究

林娜

（浙江诚德检测研究有限公司，浙江 宁波 315000）

0 引言

粪大肠菌群不仅存在于排泄物或人、动物肠道内，在各地水体环境中也检测出粪大肠菌群，这种情况会导致整个水体环境被污染，诱发肠道病原菌感染[1]。做好粪大肠菌群的检测工作，不仅能充分掌握监测水源区域粪大肠菌群的实际污染情况，而且也能为第一时间开展预测、以及流行病的控制提供有利条件。

1 粪大肠菌群检测原理及检测流程

1.1 发酵法原理及其检测流程

发酵法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠的测定。首先，针对发酵法检测原理来讲，经上文的分析可以明确，粪大肠菌群能都对乳糖起到分解作用的同时，产酸产气，在多管发酵阶段，乳糖蛋白胨培养基颜色会发生变化，并逐渐出现气泡。其次，针对发酵法检测流程来讲，粪大肠菌群主要是借助乳糖蛋白胨多管进行发酵，在实验培养阶段，应从以下5点入手：①开展无菌实验，科学合理的对其进行消毒和灭菌处理，避免实验环境存有细菌。阳性及阴性对照实验，确保阳性菌株呈阳性反应，阴性菌株呈阴性反应。②筹备水样样本，组建实验组，以水样污染程度为基础，科学合理的明确接种量。通常情况下，可采用10mL、1mL、0.1mL。③准备三倍乳糖蛋白胨培养液或者单倍乳糖蛋白胨培养液，如果接种体积为10mL 的情况下，则可应用三倍乳糖蛋白胨培养液，而针对单倍乳糖蛋白胨培养液来讲，更加适宜应用在接种体积≤1mL的情况下。④针对初发酵实验来讲，充分混匀被检测水样，并将其装入培养液试管中，值得注意的是，要确保储存试管和5 份培养液全部完成灭菌与消毒处理。并且将其放置在（37.0±0.5）℃的条件下培养（24±2）h。如果在培养的过程中发现产酸产气的现象，则证明阳性反应。⑤复发酵实验，对初发酵实验呈阳性反应的试管轻微摇晃，在恒温为（44.5±0.5）℃条件下培养（24±2）h。值得注意的是，在复发酵阶段，培养基中可能会出现其他种类菌落。若想确保目标菌落的纯度，要将其他菌落放置在温度为（45.5±0.5）℃条件下的EC 肉汤培养基中单独培养（24±2）h，在培养的过程中，要观察其是否存在阳性产气现象，如果存在，则表明滋生了粪大肠菌群。在发酵阶段，通过最大可能数MPN 值与指数关系开展科学、精准的精算工作[2]。

式中：C——样品中粪大肠菌群数，MPN/L；MPN——每100mL 样品中粪大肠菌群，MPN/100mL；f——实际水样最大接种量，mL；100——10×10mL，其中10 将MPN 值的单位MPN/100mL 转换为MPN/L，10mL 为MPN 表中最大接种量，mL。

现阶段，在我国粪大肠菌群的众多检测方式中，乳糖蛋白胨多管发酵法的应用较为常见，且在全世界范围内的应用都较为普遍。对此，世界各地研究人员在乳糖蛋白胨多管发酵法方面达成一致，此类检测方式成为国际标准检测方式。乳糖蛋白胨多管发酵法的优势为成本低、技术要求不高、不需要投入大量的人力、结果精准性较高等；劣势为实验操作过程烦琐、检测时间长，在获得实验结果之后，需要专人验证实验结果是否精准[3]。

在采用乳糖蛋白胨多管发酵法的过程中，对于实验团队人员数量也有着一定的要求，因此，基层机构难以确保乳糖蛋白胨多管发酵法的应用效果。随着我国科技水平日新月异的发展，也带动了乳糖蛋白胨多管发酵法的进一步发展，并且逐渐发展为五管法、十二管法、以及十五管法。

1.2 滤膜法原理及其检测流程

滤膜法适用于地表水、地下水、生活饮用水和工业废水中粪大肠菌群的测定，但当样品浑浊度较高时，应选用其他方法。首先，滤膜法原理如下。实验人员要做好实验环境与仪器的灭菌、消毒等工作，将微孔滤膜放入过滤器内，倒入水样，利用抽滤法对水样进行过滤。在抽滤后，细菌被截留在滤膜上。将滤膜与培养基表面充分结合在一起，并科学合理的开展接种作业，将其放置在恒温为（44.5±0.5）℃环境下实施培养，在整个培养的过程中，实验人员应对其进行全面的观察。如果培养基滋生粪大肠菌群的情况下，要求实验人员其判断是否满足粪大肠菌群特点，做好菌落计数，测定样品中粪大肠菌群浓度。

其次，滤膜法检测流程如下。①对检测水样进行过滤处理，对工具进行灭菌消毒之后，借助工具夹起灭菌滤膜边缘，观察细腻的一面，并将其放在下面，将细腻面的滤膜放入过滤器内紧贴滤床，实施灭菌处理、添加水样。添加水样时根据样品的种类判断接种量，最小的过滤体积为10mL，如接种量小于10mL 应逐级稀释。利用吸管提取待检测水样，值得注意的是，对于吸管同样也要进行灭菌消毒后方可使用，开启过滤器阀门实施负压50kPa 的抽滤。②培养细菌，在对水样进行过滤之后，对实验仪器中的气体进行抽出，5s 之后关闭过滤器阀门。将过滤器下置，带菌落膜放置在MFC 培养基表面开展接种作业。在接种的过程中，要防止滤膜吸附菌种的一面朝下，将滤膜紧密贴合在培养基表面，如若不然，则可能会对菌种的正常生长带来不利影响。在培养之后，做好培养皿的密封处理，并将其放入温度为（44.5±0.5）℃培养箱中培养（24±2）h。③对实验数据进行全面统计，计算菌落数量。粪大肠菌群颜色是蓝色或者蓝绿色，与其他菌落颜色对比来讲，粪大肠菌群颜色好区分，再加上在培养环境温度的作用下，其他菌落可能会与培养基试剂发生反应[4]。在培养中止之后，通过区分颜色，便可以判断粪大肠菌群菌落，对其数量进行统计之后，以体积与浓度关系为基础，获得每升水样中大肠菌群菌落的实际数量。计算公式：粪大肠菌群菌落数=。

最后，每次实验都要进行对照实验，分为空白对照和阳性阴性对照。空白对照即每次实验都要用无菌水进行空白测定。阳性及阴性对照即阳性菌株呈阳性反应，阴性菌株呈阴性反应。

1.3 纸片快速检测法原理及其检测流程

纸片法适用于地表水、废水中粪大肠菌群的快速测定。首先，纸片快速检测法原理如下。针对实验阶段的滤纸吸收选择性培养基来讲，要确保滤纸和培养基之间贴合的紧密性，做好培养温度与培养时间的把控，培养时间为24h。细菌在繁殖的过程中，难免会形成酸，导致溴甲酚紫指示剂颜色发生变化，与此同时，脱氢酶会促使底物还原为三苯甲臢，颜色成红色，简而言之，如果黄色背景下产生红色斑点的情况下，则可明确样品中是否滋生粪大肠菌群、以及滋生之后的粪大肠菌群浓度。其次，纸片快速检测流程如下。具体来讲，纸片快速检测法和发酵法的流程大同小异。清洁水样取10mL 水样量纸片5 张，每张接种水样10mL；然后，1mL水样量纸片10 张，其中5 张接种水样各1mL，另5 张各接种1：10 的稀释水样1mL。受污染的水样接种3 个不同稀释度的1mL 稀释水样各5 张。接种好的纸片将其放置在温度为（44.5±0.5）℃的恒温培养箱中培养18～24h，观察有无菌落形成。当然每次实验都要进行空白测定，培养后的纸片上不得有任何颜色反应，并使用标准菌株进行阳性、阴性对照实验。菌落阳性反应参考：①纸片上出现红斑或红晕且周围变黄。②纸片全片变黄，无红斑或红晕。菌落阴性反应参考：①纸片部分变黄，无红斑或红晕。②纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变黄。③纸片无变化[5]。记录菌落数量和纸片阳性情况，查MPN 值表得到MPN 值，按式（2）换算并报告1L 水样中粪大菌群数：

式中：C——水样总大肠菌群或粪大肠菌群浓度，MPN/L；M——查MPN 表得到的MPN 值，MPN/100mL；Q——实际水样最大接种量，mL；100——10×10mL，其中10将MPN 值 的 单 位MPN/100mL 转 换 为MPN/L，10mL 为MPN 表中最大接种量，mL。

1.4 酶底物法原理及检测流程

酶底物适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。首先，酶底物法原理如下。众所周知，大肠菌群菌落能形成β-半乳糖苷酶，并对乳糖起到分解的作用，从而导致培养基有菌区域颜色出现变化。统计阳性反应出现数量，计算样品中粪大肠菌群的浓度值。其次，酶底物法检测流程如下。①根据样品污染程度确定接种量，避免样品培养后出现全部阳性或全部阴性。对于未知样品，可选用多个接种量进行检测。②将被检测水样容量控制在100mL，对量瓶进行消毒、灭菌处理之后，取出100mL 测试水样或稀释样品，在水样中添加MMO-MUG 粉末，并将粉末与水样充分融合在一起。③将准备好的水样溶液全部倒入97 孔定量盘。④如果在定量盘产生气泡的情况下，用手抚平97孔定量盘背面，然后用程控定量封口机封口。⑤将其放置在温度为（44.5±0.5）℃环境下培养并观察（24±2）h。在此阶段，如果检测水样颜色发生了变化的情况下，则表明被检测水体滋生了粪大肠菌群，分别记录97 孔定量盘中大孔和小孔阳性孔数。从97 孔定量盘法MPN中查得每100mL 中粪大肠菌群的MPN 值后，再根据不同稀释度，按式（3）换算成粪大肠菌群数：

式中：C——样品中粪大肠菌群数，MPN/L；MPN——每100mL 样品中粪大肠菌群，MPN/100mL；f——实际水样最大接种量，mL；1000——将C 单位由MPN/mL 转换成MPN/L。

同样每次实验都要进行空白对照和阴性阳性对照。空白对照就是用无菌水按步骤进行测定，培养后的97 孔定量盘不得有任何颜色反应，否则该次实验判定无效。阴性阳性对照就是用标准菌株制成菌悬液，按步骤进行操作，阳性菌株呈现阳性反应，阴性菌株呈现阴性反应。

2 检测方式的检测结果对比

多管发酵法、滤膜法、纸片快速检测法以及酶底物法检测结果如表1 所示。通过对表1 的分析可以明确，粪大肠菌群不同的检测方式也存在一定的不同。针对发酵法和滤膜法来讲，发酵法流程复杂、限制因素多、可行度低，再加上发酵法所耗实验周期久，因此，发酵法应用不常见，滤膜法更为方便，但滤膜法有其局限性，其对浑浊度较高的样品，无法检测。纸片快速法与发酵法相对比而言，纸片快速法顾名思义，其操作流程简单，不需要确认实验，再加上精准度高，经济实惠等优势，其在对结果要求时间短的粪大肠菌群检测中更为常见。针对酶底物法来讲，其同样操作简单，一次实验即可完成检测，但在技术方面有着一定的难度，同时所需成本较高。

表1 粪大肠菌群不同检测方式的检测对比

3 结语

综上所述，在粪大肠菌群检测中，发酵法、滤膜法的应用较为普遍，值得注意的是，粪大肠菌群不同的检测方式，都有其独特的优势与劣势，因此，在粪大肠菌群检测未来发展的过程中，要求业内人士加大不同检测方式的研究力度，尽可能减少检测成本的同时，避免投入大量的检测时间，与此同时，也要注重检测效率和检测结果精准性的提升。