改良取材涂片法镜检对足癣真菌阳性率的影响*

许立明 胡莉 胡丝威 敖细红 吴海宝

真菌是一类具有典型核结构与完整细胞器、形态各异、大小不一的真核细胞微生物[1]。真菌是植物、昆虫及人类主要的致病菌，在临床上将因真菌感染所引起的疾病称为真菌病，根据其感染部位不同分为浅部真菌病与深部真菌病[2-3]。近年来，随着全球卫生环境的改善、医疗技术的进步，深部真菌病发病率呈现出下降趋势[4]。但浅部真菌病仍是困扰人类的疾病之一，其中以足癣最为常见[5]。虽然足癣并不会威胁患者生命，但其常伴有瘙痒、糜烂等症状，且以上症状常于夏季潮湿闷热时加重，严重影响患者日常生活。因此，精准检出足癣并实施对症治疗对提高患者生活质量具有重要意义。近年来，足癣真菌检查已逐渐形成规范化诊断流程，常采用直接镜检与真菌培养相结合的形式[6]。但常规取材涂片直接镜检需用钝刃刮取样本，存在创伤风险。而真菌培养则需2～4 周时间，诊断周期过长。因此，临床急需一种快速、高效、精准的检查手段。改良取材涂片法镜检无需使用刀刃刮取，且耗时较短，因此，考虑将其应用于足癣检查。为分析该种检查手段的临床应用价值，本研究特选取100 例疑似为足癣患者为试验对象，对比改良取材涂片法镜检与常规取材涂片直接镜检法的诊断效果并分析改良取材涂片法镜检的应用价值。现分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性随机对照研究，选取新余银河医院2020 年10 月—2022 年9 月收治的100 例高度疑似足癣的患者作为研究对象。纳入标准：（1）参照文献[7]《中国临床皮肤病学》，临床表现为脚趾间起水疱、糜烂或皮肤增厚开裂、瘙痒等，高度疑似足癣；（2）首次发病。排除标准：（1）就诊前使用过抗真菌类药物；（2）足部合并皮疹、银屑病等其他皮肤疾病；（3）合并全身感染性疾病；（4）合并糖尿病足、炭疽、蜂窝织炎等。剔除标准：（1）未接受完整检查；（2）选取切片样本污染。采用随机数字表法将患者分为两组，试验组和对照组各50 例。本研究所有材料均已上交本院医学伦理委员会，经过讨论，予以批准实施。患者均同意参与本研究。

1.2 方法

（1）改良取材涂片法镜检。①取材：暴露足部病变部位，使用一次性棉签（生产厂家：成都明森医疗器械有限责任公司，注册证编号：川械注准20172140060，型号规格：Ⅰ型）蘸取氯化钠注射液（生产厂家：辰欣药业股份有限公司，批准文号：国药准字H20056758，规格：50 mL∶0.45 g），使用一侧在典型病变皮损部位或新发皮损边缘来回擦拭10 次左右，后转换到棉签另一侧再次反复涂取10 次左右。②检查：在载玻片中间滴加2～4 滴生理盐水，顺时针涂抹组织样本，后将其放入光学显微镜（生产厂家：重庆奥特光学仪器有限责任公司，注册证编号：渝械注准20192220096，型号规格：B203LED）下观察，先使用低倍镜查找菌丝或孢子，找到疑似目标后使用高倍镜再次确认检查结果。（2）常规取材涂片直接镜检法。①取材：暴露足部皮损部位，使用70%酒精消毒后用钝刃的手术刀刮取典型皮损组织或新发皮损部位边缘提取组织样本。②检查：将组织样本放置于载玻片中央，滴入1～2 滴的10%氢氧化钾浮载液[40%二甲基亚砜+10%甘油]后等待片刻，盖上盖玻片，将其快速从酒精灯外焰上往复2～3 次，使组织样本中的角质充分溶解，加热过程中注意把握温度，避免烤干结晶。轻轻挤压盖玻片，排出其中气泡的同时压缩样本，使得样本呈现出微透明状态，并用吸水纸将周围溢出的液体除去，后将其放置于低倍显微镜下观察，确定疑似目标后，将其放置于高倍显微镜下确认孢子形态，在检查时应避免强光影响。（3）真菌培养。①取材同常规取材涂片直接镜检法；②检查：将所提取的组织样本随机分成2 等份后分别接种于2 个真菌培养基（温州市康泰生物科技有限公司；沙保罗琼脂）中，将其中一个培养基放置于28 ℃恒温培养箱（山东博科科学仪器有限公司；BJPX-H54）中，另一个放置于37 ℃培养箱中进行双管培养，培养时间：2～4 周，定期观测培养结果。试验组采用改良取材涂片法镜检，对照组采用常规取材涂片直接镜检法，两组均进行真菌培养。（4）质量控制。①遵循自愿原则成立课题研究小组，研究团队由3 名主治医师与2 名主管检验技师构成，小组成员皆具有丰富的临床经验。在试验开始前由专业人士对小组成员进行培训，并考核医务人员的检查操作专业性、结果判读准确性等。②根据研究课题，查找相关文献，从理论层面设计研究步骤、原理及操作注意事项等，并对各部该研究课题的实用价值进行论证。③由2 名主管检验技师单独读取判定结果，如若遇到不一致情况则需请上级专家再次解读，以其判定结果为准。

1.3 观察指标及判定标准

1.3.1 疼痛程度 在完成取材后，使用视觉模拟评分法（visual analogue scale，VAS）评估两组患者在取材时的疼痛程度。0 分代表完全无痛，10 分代表疼痛难以忍受，分数越高提示患者取材时的疼痛程度越严重。

1.3.2 阳性判定标准 参照文献[8]《医学真菌学》中相关镜检形态学特征判断。（1）直接镜检：组织样本中镜下可见分支、分隔菌丝，可断裂或形成关节孢子；菌落形态可呈毛型、羊毛状、粉型、粉末状、绒毛状或沟纹状，可见表面呈现出白色过渡到乳油色，背面呈现出黄褐色；亦可见表面呈现白色过渡到粉色，背面呈现出酒红色。（2）真菌培养：绒毛状、沟纹状或绒毛状，表现为分支、分隔、粗细较为类似的菌丝，孢子常直接从菌丝中生长出，大分生孢子呈香烟或铅笔状，小分生孢子呈泪滴状、棒形、球形、梨形，偶尔可见蜈蚣状，或可不见大分生孢子。

1.4 统计学处理

使用SPSS 25.0 统计学软件分析。经Shapiro-Wilk 检验符合正态分布的计量数据用（±s）表示，使用独立样本t 检验；计数资料用率（%）表示，行χ2检验；采用Kappa 一致性检验改良取材涂片法镜检、常规取材涂片直接镜检法与真菌培养结果的诊断一致性；0.21＜Kappa 值≤0.40，提示二者检查结果一致性一般；0.41＜Kappa 值≤0.60，提示二者一致性中等；0.61＜Kappa 值≤0.80，提示二者具有较强一致性；0.81＜Kappa 值＜1，提示二者具有强一致性，Kappa 值=1，提示二者结果完全一致。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料

试验组男27 例，女23 例；年龄20～40 岁，平均（30.12±5.12）岁；病程个4～10 个月，平均（7.69±1.25）个月；疾病类型：水疱型17 例、糜烂型23 例、鳞屑角化型10 例。对照组男29 例，女21 例；年龄20～40 岁，平均（30.56±5.39）岁；病程4～10 个月，平均（7.45±1.98）个月；疾病类型：水疱型21 例、糜烂型20 例、鳞屑角化型9 例。两组患者一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 诊断一致性

试验组，经真菌培养检出真菌阳性46 例，阴性4 例，改良取材涂片法镜检检出真菌阳性45 例，阴性5 例，Kappa 一致性检验显示，改良取材涂片法镜检与真菌培养检出结果具有较强一致性（Kappa=0.634，P＜0.001）。对照组经真菌培养检出真菌阳性46 例，阴性4 例，常规取材涂片直接镜检法检出阳性38 例，阴性12 例，Kappa 一致性检验显示，常规取材涂片直接镜检法与真菌培养检出结果具有一般一致性（Kappa=0.290，P＜0.05）。见表1、2。

表1 试验组改良取材涂片法镜检检出结果（例）

表2 对照组常规取材涂片直接镜检法检出结果（例）

2.3 诊断效能

改良取材涂片法镜检的敏感度、准确度均高于常规取材涂片直接镜检法，差异均有统计学意义（P＜0.05）；两者特异度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 改良取材涂片法镜检与常规取材涂片直接镜检法诊断效能比较（%）

2.4 两组患者疼痛程度比较

试验组患者VAS 评分为（1.22±0.31）分，对照组为（1.45±0.52）分，试验组明显低于对照组，差异有统计学意义（t=2.686，P＜0.05）。

3 讨论

足癣具有极强的传染性，不仅局限于机体之间的传染，还可侵染患者其他健康组织，例如手癣多由触碰足部病损皮肤而感染真菌所致，足癣真菌侵染患者甲床形成甲癣[9]。因此，尽早检出足癣有助于避免真菌扩散感染其他组织[10-11]。常规取材涂片直接镜检法是临床上最为常用的早期筛查足癣的技术手段，具有快捷、经济成本低廉的优点。但临床观察发现，常规取材涂片直接镜检法的真菌阳性检出率与真菌培养结果之间存在差距，极易出现误诊、漏诊情况[12]。因此，改良取材涂片法镜检逐渐应用于足癣真菌检查中，但目前仍无明确循证证据支持其诊断率高于常规取材涂片直接镜检法。因此，本研究比较二者之间的诊断效能，为完善足癣真菌检查方案提供理论支持。

研究结果显示，相较于常规取材涂片直接镜检法，改良取材涂片法镜检检出真菌阳性与真菌培养结果的一致性更高。分析可能与以下几方面有关。首先，两种直接镜检法在取材手段上有所区别。常规取材涂片直接镜检法是利用钝刃手术刀刮取患者的样本组织，在刮取过程中会造成样本皮损细屑组织相互堆叠，且多集中于刀刃处，遮挡读取视线[13-14]；另外该种刮取方式会影响真菌分布区域的均衡性，增加读取区域偏差的可能性[15]。而改良取材涂片法镜检是利用湿润棉签擦拭皮损组织，大大减少了皮屑的堆积；与此同时，在往复擦拭间还能避免真菌出现分布不均的情况，从而提高真菌阳性检出率[16]。另外，改良取材涂片法镜检在提取组织样本之前无需对皮损部位消毒，进而避免因酒精消毒造成的真菌损失，最大限度地保留患者足部真菌的真实状况，进而提高阳性检出率[17-18]。不仅如此，常规取材涂片直接镜检法在检查过程中需要滴入氢氧化钾溶液且需用酒精灯加热，容易出现角质溶解不彻底的情况，进而降低阳性检出率[19-20]。而改良取材涂片法镜检无需溶解角质，可有效避免以上情况出现，提高真菌阳性检出率。

研究结果还显示，试验组患者取材时VAS 评分明显高于对照组，说明改良取材涂片法镜检可有效减轻患者取材时的疼痛程度。分析原因，常规取材涂片直接镜检法是使用钝刃刮取，存在一定的致损风险；另外刮取时需施以一定的压力，易造成患者出现疼痛[21]。而改良取材涂片法镜检则是用来回蘸取的方式，不损伤皮损部位，无需施以压力，因此患者不易感觉疼痛。

值得注意的是，不论是改良取材涂片法镜检还是常规取材涂片直接镜检法均为人工采集、检验。不规范的操作方式会影响其结果的判断。因此为提高真菌阳性检出率需注意以下几点：（1）取材时应尽量做到多部位采集，且保证提取量充足。（2）转运过程中避免污染样本。（3）在镜检观察时尽量读取多范围结果。（4）取材前应告知患者避免涂抹抗菌性药物。

虽然本研究明确了改良取材涂片法镜检对足癣真菌阳性的检出价值，但仍存在诸多不足，例如未对比改良取材涂片法镜检对不同足癣疾病分型中真菌阳性的检出价值；另外真菌培养可以检出菌种情况，而直接镜检在此方面仍有欠缺，是否可以再将其进行改良提高对菌种判定的价值还有待探究。

综上所述，相较于常规取材涂片直接镜检法，改良取材涂片法镜检对足癣真菌阳性具有更高的检出率。